Hasil Pencarian  ::  Simpan CSV :: Kembali

"Indonesia memiliki ketergantungan terhadap impor kit untuk Polymerase Chain Reaction (PCR). Salah satu komponen krusial dalam PCR adalah DNA polimerase termostabil. Hal ini tidak sebanding dengan Indonesia yang terletak pada Ring of Fire, dimana Indonesia memiliki potensi ekosistem geothermal yang besar sebagai habitat bakteri termofilik penghasil DNA polimerase termostabil. Gen DNA pol I lokal dari Geobacillus thermoleovorans Batu Kuwung, Banten, telah berhasil dikloning pada plasmid pET-15b dan ditransformasikan pada Escherichia coli BL21. Meskipun GBK pol memiliki peran yang sangat penting dalam amplifikasi isothermal yang menjadikannya dapat diaplikasikan dalam PCR, untuk dapat memproduksi GBK pol secara komersil masih dinilai kurang layak secara ekonomi. Penelitian yang telah dilakukan untuk GBK pol masih memiliki keterbatasan dalam optimalisasi dan produksi scale-up. Oleh karena itu, pada penelitian ini dilakukan optimasi kondisi ekspresi seperti: kecepatan agitasi, waktu inkubasi setelah induksi, volume kerja dan peningkatan skala produksi pada 7,5 L bioreaktor untuk meningkatkan efisiensi, produksi dan ekspresi. Pada penelitian ini didapatkan kondisi optimum pada kecepatan agitasi 200 rpm, waktu inkubasi setelah induksi 4 jam dan 20% volume kerja. Selain itu, pada penelitian ini berhasil dilakukan produksi GBK pol pada 7,5 L bioreaktor dan menghasilkan konsentrasi protein tertinggi sebesar 0,042 µg/µL dengan waktu optimum untuk inkubasi setelah induksi selama 3 jam.

---

Indonesia relies on imported kits for Polymerase Chain Reaction (PCR). In fact, one of the crucial components in PCR is thermostable DNA polymerase. This is not comparable to Indonesia’s potential which is located on the Ring of Fire. Consequently, Indonesia holds the potential for a large geothermal ecosystem which serves as a habitat for thermophilic bacteria capable of producing thermostable DNA polymerase. The local DNA pol I gene from Geobacillus thermoleovorans Batu Kuwung, Banten, has been successfully cloned into the plasmid pET-15b and transformed into Escherichia coli K pol in isothermal amplification, making it applicable for PCR, the commercial production of GBK pol is still considered economically unfeasible. The research conducted for GBK pol still has limitations in optimization and scale-up production. Therefore, in this study optimization of expression conditions was carried out, including the speed of agitation, post-induction incubation time, working volume and scale-up production at 7,5 L bioreactor to increase efficiency, production, and expression. In this study, the optimum conditions were obtained at an agitation speed of 200 rpm, a post-induction incubation time of 4 hours and 20% working volume. Furthermore, the production of GBK pol was successfully carried out in a 7.5 L bioreactor, resulting in the highest protein concentration of 0.042 µg/µL with the optimum post-induction incubation time for 3 hours."

"

Sistem dehidrasi glikol di Lapangan X bertujuan untuk menjaga kandungan air pada gas jual di bawah 10 lbs/MMSCFD sesuai permintaan konsumen. Dengan kondisi operasi saat ini, terdapat permasalahan kehilangan glikol yang menyebabkan biaya operasional bertambah. Penyebab kehilangan glikol dapat disebabkan oleh berbagai macam faktor, diantaranya karena permasalahan kadar keasaman (pH) yang tidak netral pada sirkulasi glikol (Azubuike & Michael, 2017) serta terjadinya oksidasi pada make up tank (Trueba et al., 2022). Pada Lapangan X, kondisi operasi tersebut pun terjadi, yaitu pH sirkulasi glikol berkisar antara 5 hingga 6 yang terukur pada make up tank. Terdapat beberapa metode untuk mengatasi kehilangan glikol, diantaranya penerapan Pre-Inhibited Glycol dan Nitrogen Blanketing. Makalah tesis ini membahas tentang pemecahan masalah kehilangan glikol dengan analisis proses pada kondisi aktual dan penerapan modifikasi Pre-Inhibited Glycol, Nitrogen Blanketing dan Metode Kombinasi Pre-Inhibited Glycol - Nitrogen Blanketing. Perangkat lunak yang digunakan untuk simulasi adalah Aspen HYSYS v11. Tujuan dari simulasi proses modifikasi ini adalah mendapatkan variabel kehilangan glikol fraksi massa TEG > 0.98 dan kadar air pada sales gas kurang dari 10 lbs/MMSCF. Analisis keekonomian dilakukan untuk menilai kelayakan modifikasi pada glikol dengan kriteria NPV ≥ 0, IRR ≥ WACC dan Payback Period ≤ 10 tahun. Berdasarkan hasil 100 studi kasus pada simulasi Aspen HYSYS, metode Nitrogen Blanketing merupakan metode yang memenuhi kelayakan teknis dengan parameter fraksi massa TEG sebesar 0.9808 – 0.9860, water content sebesar 9.15 – 12.04, dan pH 6.78 – 6.87. Secara kelayakan ekonomis, metode Nitrogen Blanketing juga layak dengan nilai IRR, NPV dan Payback Period berturut-turut sebesar 31.9%, Rp. 31.143.295 dan 1 tahun. 

---

The glycol dehydration system in Field X aims to maintain the water content of selling gas below 10 lbs/MMSCFD according to consumer demand. With current operating conditions, there is a problem of glycol loss, which causes operational costs to increase. The cause of glycol loss can be caused by various factors, including the problem of non-neutral acidity (pH) in glycol circulation (Azubuike & Michael, 2017) and oxidation in the makeup tank (Trueba et al., 2022). In Field X, the operating conditions also occur, namely that the circulating pH of glycol ranges from 5 to 6, which is measured in the make-up tank. There are several methods to overcome glycol loss, including the application of Pre-Inhibited Glycol and Nitrogen Blanketing. This research discusses solving the problem of glycol loss by analyzing the process under actual conditions and applying modified Pre-Inhibited Glycol, Nitrogen blanketing, and Pre-Inhibited Glycol-nitrogen blanketing combination methods. The software used for the simulation is Aspen HYSYS v11. The purpose of this modification process simulation is to obtain a variable loss of glycol mass fraction TEG > 0.98 and a water content in sales gas of less than 10 lbs/MMSCF. Economic analysis was carried out to assess the feasibility of modifying glycol with the criteria of NPV ≥ 0, IRR ≥  WACC, and Payback Period ≤ 10 years. Based on the results of 100 case studies on the Aspen HYSYS simulation, the Nitrogen Blanketing method is a method that meets technical feasibility with TEG mass fraction parameters of 0.9808–0.8860, water content of 9.15–12.04, and pH 6.78–6.77. In terms of economic feasibility, the Nitrogen Blanketing method is also feasible with IRR, NPV, and Payback Period values ​​of 31.9%, Rp. 31,143,295 and 1 year.

"

"CRISPR-Cas9 dan CRISPR-dCas9 adalah teknologi gen yang sangat dibutuhkan untuk kegiatan produksi dan kebutuhan diagnosis. Namun, Cas9 dan dCas9 yang paling banyak digunakan dalam CRISPR-Cas9 dan dCas9 saat ini, yang dihasilkan dari Streptococcus pyogenes, tergolong dalam Cas9 dan dCas9 mesofilik yang akan terdenarurasi saat suhu diatas 45oC sehingga dibutuh versi yang lebih kuat, yaitu Cas9 dan dCas9 termofilik. Dalam eksplorasi di Mata Air Panas Cisolong, Banten, Cas9 termofilik berhasil ditemukan dalam Geobacillus kaustophilus. Namun, belum ada studi rancangan panjang setiap bagian sgRNA yang tepat terhadap Cas9 dan dCas9 Geobacillus kaustophilus. Penelitian ini menjawab permasalahan tersebut dengan simulasi molecular docking dengan menggunakan website HDOCK untuk menguji interaksi antara variasi panjang setiap bagian sgRNA, yaitu spacer, repeat, dan tracrRNA, di Cas9 dan dCas9 Geobacillus kaustophilus dilihat dari besar afinitas pengikatan. Interaksi antarmolekul dari hasil simulasi tersebut dianalisis dengan Ligplot+. Hasil molecular docking menunjukkan bahwa sgRNA yang cocok untuk Cas9 dan dCas9 Geobacillus kaustophilus adalah sgRNA variasi tracrRNA 63 nt. Pengubahan panjang bagian sgRNA cenderung mempengaruhi jumlah ikatan yang terbentuk dalam kompleks sgRNA-Cas9 dan dCas9 Geobacillus kaustophilus sehingga mempengaruhi nilai afinitas pengikatan yang dihasilkan.

---

CRISPR-Cas9 and CRISPR-dCas9 are gene technologies that urgently needed for production activities and diagnosis. However, the Cas9 and dCas9 that are most widely used in CRISPR-Cas9 and dCas9 at present, which are produced from Streptococcus pyogenes, belong to the mesophilic Cas9 and dCas9 which will be denatured when the temperature is above 45oC so a stronger version is needed, namely thermophilic Cas9 and dCas9. During exploration at Cisolong Hot Springs, Banten, thermophilic Cas9 was found in Geobacillus kaustophilus. However, there is no proper sgRNA segment length study design against Cas9 and dCas9 Geobacillus kaustophilus. This study addresses this problem by simulating molecular docking using the HDOCK website to examine the interaction between variations in the length of each sgRNA section, namely spacer, repeat, and tracrRNA, in Cas9 and dCas9 Geobacillus kaustophilus seen from the large binding affinity. The intermolecular interactions from the simulation results were analysed with Ligplot+. Molecular docking results showed that the sgRNA suitable for Cas9 and dCas9 Geobacillus kaustophilus was 63 nt tracrRNA variation. Changing the length of the sgRNA section tends to affect the number of bonds formed in the sgRNA-Cas9 and dCas9 Geobacillus kaustophilus complexes thereby affecting the resulting binding affinity values.

"

"Enzim Cas9 merupakan bagian dari CRISPR-Cas9 yang berperan sebagai endonuklease untuk memotong DNA/RNA pada sekuens yang spesifik. Enzim Cas9 berguna dalam bidang kesehatan, pangan, dan industri. Namun, banyak industri yang beroperasi pada suhu tinggi sehingga enzim Cas9 pada umumnya tidak dapat digunakan dan diperlukan enzim Cas9 yang termostabil. Akan tetapi, belum banyak penelitian mengenai jenis enzim Cas9 termostabil. Oleh sebab itu, mengetahui adanya Cas9 pada isolat lokal Geobacillus kaustophilus TBUI01, dilakukan produksi enzim Cas9 dengan teknik rekombinan pada Escherichia coli BL21. Enzim Cas9 kemudian dipanaskan untuk menghilangkan semua protein mesofilik dari Escherichia coli BL21 pada suhu 50oC, 60oC, dan 70oC. Lalu dipurifikasi dengan teknik presipitasi amonium sulfat dengan variasi fraksinasi 20%, 50%, dan 80%. Sampai saat ini, belum ada penelitian enzim Cas9 tahan panas yang menggunakan presipitasi amonium sulfat sebagai satu-satunya teknik purifikasi. Teknik ini dilakukan karena ekonomis, cepat, dan juga mudah dilakukan. Hasil menunjukkan bahwa suhu pemanasan 60 oC adalah suhu yang optimal untuk mendegradasi protein mesofilik tanpa mendegradasi enzim Cas9. Presipitasi amonium sulfat optimal dilakukan pada fraksinasi 50% karena mampu mempresipitasi enzim Cas9. Akan tetapi, masih ada protein lain yang berhasil dipresipitasi sehingga presipitasi amonium sulfat dapat dijadikan sebagai langkah purifikasi awal untuk mengonsentrasikan protein.

---

The Cas9 enzyme is part of CRISPR-Cas9 which acts as an endonuclease to cut DNA/RNA in specific sequences. Cas9 is useful in the fields of health, food, and industry. However, many industries operate at high temperatures so that Cas9 enzymes generally cannot be used and a thermostable Cas9 enzyme is needed. Nevertheless, there has not been much research on the type of thermostable Cas9 enzyme. Therefore, knowing the presence of Cas9 in the local isolate Geobacillus kaustophilus TBUI01, Cas9 enzyme production was carried out using recombinant techniques on Escherichia coli BL21. The Cas9 enzyme was then heated to remove all mesophilic protein from Escherichia coli BL21 at 50oC, 60oC and 70oC. Then it was purified by ammonium sulfate precipitation technique with 20%, 50% and 80% saturation. Until now, there has been no research on thermostable Cas9 using ammonium sulfate precipitation as the only purification technique. This technique is done because it is economical, fast, and easy to do. The result showed that a heating temperature of 60oC is the optimal temperature for degrading mesophilic proteins without degrading Cas9 enzymes. Optimal ammonium sulfate precipitation is carried out at 50% fractionation because it can precipitate the Cas9 enzyme. However, there are still other proteins that have been successfully precipitated so that the precipitation of ammonium sulfate can be used as an initial purification step to concentrate protein."

"Sistem CRISPR-Cas9 merupakan mekanisme perlindungan bakteri terhadap materi genetik asing yang diaplikasikan secara luas dalam rekayasa genetika. Kombinasi enzim Cas9 dengan gRNA pada CRISPR-Cas9 memungkinkan terjadinya pengeditan genom terhadap target yang spesifik. Meskipun demikian, Cas9 yang dikembangkan saat ini berasal dari bakteri mesofilik sehingga rentan terdegradasi dan tidak cocok untuk aplikasi pada temperatur tinggi. Di sisi lain, bakteri termofilik Geobacillus kaustophilus telah diisolasi dari mata air panas di Cisolong, Banten, dan diidentifikasi mengandung enzim Cas9. Untuk memperoleh enzim Cas9 yang tidak terdenaturasi pada temperatur tinggi (termostabil), dilakukan uji coba produksi Cas9 rekombinan dari Geobacillus kaustophilus. Gen Cas9 yang telah dikloning pada plasmid pET43.1a ditransformasikan ke dalam Escherichia coli BL21 dan dikultur dengan konsentrasi penambahan IPTG yang bervariasi—0,05 mM, 0,20 mM, dan 0,50 mM. Hasil kultur bakteri dipanaskan pada temperatur yang bervariasi (50 °C, 60 °C, dan 70 °C) untuk mendenaturasi enzim non-termofilik. Setelah itu, sampel dipurifikasi dengan mmobilized Metal Affinity Chromatography untuk memperoleh enzim Cas9. Hasil uji Lowry menunjukkan sampel heated supernatant dengan konsentrasi IPTG 0,05 mM dan temperatur pemanasan 50 °C memiliki konsentrasi protein tertinggi dan hasil purifikasinya memiliki konsentrasi Cas9 sebesar 42,6 μg/mL. Identifikasi protein dengan uji SDS-PAGE menunjukkan ukuran protein hasil purifikasi sebesar 52,61 kDa.

---

The CRISPR-Cas9 system is a bacterial defense mechanism against foreign genetic material that is broadly applied in genetic engineering. The combination of Cas9 enzyme and gRNA in CRISPR-Cas9 allows genome editing of specific targets. However, the currently developed Cas9 originated from mesophilic bacteria, making it susceptible to degradation and unsuitable for applications requiring elevated temperatures. On the other hand, the thermophilic bacterium, Geobacillus kaustophilus, was isolated from a hot spring in Cisolong, Banten, and identified as containing the Cas9 enzyme. To obtain undenatured Cas9 enzymes at high temperatures (thermostable), a production test of recombinant Cas9 from Geobacillus kaustophilus was carried out. The Cas9 gene cloned on the pET43.1a plasmid was transformed into Escherichia coli BL21 and cultured under various IPTG addition concentrations—0.05 mM, 0.20 mM, and 0.50 mM. The bacterial cultures were heated at various temperatures (50 °C, 60 °C, and 70 °C) to denature unwanted non-thermophilic enzymes. Thereafter, the samples were purified using Immobilized Metal Affinity Chromatography to obtain Cas9 enzyme. Lowry protein assay results showed that the heated supernatant sample with 0.05 mM IPTG addition and 50 °C heating temperature has the highest protein concentration, and the purified sample yielded a Cas9 concentration of 42.6 μg/mL. Protein identification with SDS-PAGE revealed a purified protein size of 52.61 kDa"

"Perkembangan teknologi penyuntingan genom clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR) memberikan kemampuan pada ilmuwan untuk memodifikasi sekuens genom pada sebagian besar sel eukariot. Selain untuk insersi dan delesi gen, penelitian sistem CRISPR-Cas9 juga telah menuju ke arah perkembangan represor transkripsional artifisial CRISPR interference (CRISPRi) dengan sistem dCas9 untuk rekayasa metabolisme melalui penyuntingan metabolic pathways.  dCas9 yang merupakan turunan dari Cas9 saat ini umumnya diproduksi oleh bakteri Streptococcus pyogenes yang merupakan bakteri mesofilik dan menyebabkan Cas9 dan dCas9 yang berasal dari Sterptococcus pyogenes memiliki limitasi terhadap suhu tinggi.  Saat ini eksplorasi terhadap bakteri termofilik sebagai sumber gen Cas9-dCas9 sedang berkembang. Salah satunya adalah bakteri Geobacillus kaustophilus yang tumbuh pada suhu optimal 60˚C dan dapat hidup hingga suhu 74˚C. Dalam penelitian ini, produksi enzim dCas9 dilakukan menggunakan Escherichia coli BL21 sebagai host dan dipurifikasi Immobilized metal affinity chromatography (IMAC). Variasi pemanasan supernatant dilakukan untuk suhu 50˚C, 60˚C, dan 70˚C sebelum purifikasi. Terdapat penurunan konsentrasi protein total dengan semakin tinggi suhu pemanasan, dengan konsentrasi protein total tertinggi pada suhu 50˚C. Purifikasi dilakukan menggunakan 3 buffer elusi dengan konsentrasi imidazole berbeda (250 mM, 350 mM, dan 450 mM). Konsentrasi imidazole 350 mM pada buffer elusi menghasilkan protein dengan konsentrasi total paling tinggi. SDS PAGE silver staining dilakukan untuk melihat berat molekul protein rekombinan yang telah dipurifikasi, dan protein terpurifikasi muncul pada pita ~50 kDa.

---

The development of clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR) genome editing technology has given scientists the ability to modify the genome sequences of most eukaryotic cells. In addition to gene insertion and deletion, research on the CRISPR-Cas9 system has also led to the development of artificial transcriptional CRISPR interference repressors (CRISPRi) with the dCas9 system for metabolic engineering through editing of metabolic pathways. dCas9 which is a derivative of Cas9 is currently generally produced by Streptococcus pyogenes which is a mesophilic bacterium and causes Cas9 and dCas9 derived from Streptococcus pyogenes to have limitations against high temperatures. Currently, exploration of thermophilic bacteria as a source of Cas9-dCas9 genes is rising. One of them is the bacterium Geobacillus kaustophilus which grows at an optimal temperature of 60˚C and can live up to 74˚C. In this study dCas9 recombinant production was carried out using Escherichia coli BL21 as the host and Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC) purification. Variation of supernatant heating was carried out for temperatures of 50˚C, 60 ˚C, and 70 ˚C before purification. There was a decrease in total protein concentration with higher heating temperature, with the highest total protein concentration at 50 ˚C. Purification was carried out using 3 elution buffers with varying imidazole concentrations (250 mM, 350 mM, and 450 mM). The imidazole concentration of 350 mM in the elution buffer produced fractions with the highest total protein concentration. SDS PAGE silver staining was performed to determine the molecular weight the purified fraction, and bands appeared in the ~50 kDa band."

"Tingginya jumlah penyakit di Indonesia membutuhkan penanganan yang cepat dan efektif, sayangnya medikasi yang tersedia saat ini walau efektif dapat berdampak buruk apabila digunakan terus-menerus. Sebagai contoh, obat kemoterapi yang digunakan untuk menangani kanker apabila digunakan terus-menerus dapat menyebabkan rambut rontok dan disfungsi neurologi. Dibutuhkan pengembangan medikasi baru dengan efek samping yang lebih ringan dan mudah didapat secara lokal, salah satu kandidat medikasi baru yang berpotensi adalah racun binatang yang bersumber dari Calloselasma rhodostoma. Pada penelitian ini dilakukan pengujian aktivitas terhadap racun dan peptida turunan C. rhodostoma sebagai anti bakteri, anti jamur dan anti kanker dengan metode difusi cakram Kirby Bauer terhadap Escherichia coli dan Candida albicans serta metode MTT Assay terhadap sel kanker payudara Michigan Cancer Foundation-7 (MCF-7). Hasil penelitian menunjukkan besar zona inhibisi untuk jamur dan bakteri sebesar kontrol negatifnya, hal ini menandakan bahwa racun dan peptida yang diuji tidak memiliki aktivitas anti bakteri maupun anti jamur pada konsentrasi yang diuji berdasarkan dengan Lethal dose (LD50). Sedangkan untuk hasil uji kanker didapatkan beberapa peptida dapat menginhibisi sel MCF-7 berdasarkan nilai Half-maximal inhibitory concentration (IC50). Peptida tersebut yaitu IK8 dengan IC50 sebesar 18,82 ppm, LK16 dengan IC50 sebesar 63,18 ppm dan peptida VK10 dengan IC50 sebesar 180,67 ppm.

---

The high number of diseases in Indonesia requires fast and effective treatment, unfortunately the currently available medications, although effective, can have a negative impact if used continuously. For example, chemotherapy drugs used to treat cancer if used continuously can cause hair loss and neurological dysfunction. It is necessary to develop new medications that have milder side effects and are easy to procure locally. Such potential for new medication candidate is animal venom sourced from C. rhodostoma. In this study, activity test was carried out on toxins and peptides derived from C. rhodostoma as anti-bacterial, anti-fungal and anti-cancer using the Kirby Bauer Disk Diffusion method against Escherichia coli and Candida albicans and using MTT Assay method against Michigan Cancer Foundation-7 (MCF-7). The results of the study showed that the inhibition zone for fungi and bacteria had the same value as the negative control, this indicates that the toxins and peptides tested did not have anti-bacterial or anti-fungal activity at the concentrations tested based on lethal dose (LD50). Meanwhile, for cancer test results, it was found that several peptides could inhibit MCF-7 cells based on the Half-maximal inhibitory concentration (IC50) value. These peptides were IK8 with IC50 of 18,82 ppm, LK16 with an IC50 of 63,18 ppm and VK10 with IC50 of 180,67 ppm."

"Rekayasa genetika adalah proses yang melibatkan perubahan struktur genetik suatu organisme dengan menghilangkan, memasukkan, atau memodifikasi materi genetik yang terdapat pada objek yang dituju. Salah satu teknik rekayasa genetika adalah pengeditan gen. Metode pengeditan gen yang paling populer saat ini adalah CRISPR-Cas9 yang merupakan singkatan dari clustered regularly interspaced short palindromic repeat-associated protein 9. Penelitian ini mengkaji aktivitas Cas9 dengan sgRNA dari bakteri Geobacillus kaustophilus secara in silico dan in vitro. Pada percobaan in silico digunakan metode molecular docking untuk mengkaji interaksi biomolekuler dengan variasi sgRNA yaitu spacer 10, 20, 30 nt; repeat 16, 25, 36 nt; dan tracrRNA 63, 98, 140 nt. Didapatkan hasil bahwa perubahan panjang spacer, repeat, dan tracrRNA dapat mempengaruhi tingkat besar afinitas pengikatan yang terbentuk dalam kompleks YebF-Cas9-sgRNA dari Geobacillus kaustophilus. Panjang optimal dari hasil molecular docking secara afinitas dan posisi yaitu pada variasi spacer 30 nt dengan repeat 16 nt dan tracrRNA 98 nt serta besar afinitas pengikatan –419,24 kkal/mol. Sedangkan pada percobaan in vitro, enzim Cas9 rekombinan dilakukan fusi enzim pembawa YebF dan diuji aktivitasnya menggunakan metode gel elektroforesis dengan variasi suhu inkubasi pada 30°C dan 50°C serta variasi konsentrasi enzim yaitu 9,4 μM dan 20,1 μM. Dari hasil gel elektroforesis, belum dapat hasil yang signifikan baik dalam uji aktivitas, pengaruh variasi suhu, maupun pengaruh variasi konsentrasi enzim.

---

Genetic engineering is a process that involves changing the genetic structure of an organism by removing, inserting, or modifying genetic material contained in the target object. One of the genetic engineering techniques is gene editing. The most popular gene editing method today is CRISPR-Cas9 which stands for clustered regularly interspaced short palindromic repeat-associated protein 9. This study examines the activity of Cas9 with sgRNA from the bacteria Geobacillus kaustophilus in in silico and in vitro way. In the in silico experiment, the molecular docking method was used to study biomolecular interactions with variations in sgRNA, namely spacer 10, 20, 30 nt; repeat 16, 25, 36 nt; and tracrRNA 63, 98, 140 nt. The results showed that changes in the length of the spacer, repeat, and tracrRNA can affect the level of binding affinity formed in the YebF-Cas9-sgRNA complex from Geobacillus kaustophilus. The optimal length of the molecular docking results in terms of affinity and position is in the variation of 30 nt spacer with 16 nt repeat and 98 nt tracrRNA and the binding affinity is –419.24 kcal/mol. While in the in vitro experiment, the recombinant Cas9 enzyme was fused with the YebF carrier enzyme and its activity was tested using the gel electrophoresis method with variations in incubation temperature at 30°C and 50°C and variations in enzyme concentration (9.4 μM and 20.1 μM). From the results of gel electrophoresis, there are no significant results were obtained in the activity test, the effect of temperature variations, or the effect of enzyme concentration variations."

"Kemajuan dalam teknologi penyuntingan genom menggunakan Clustered Regularly  Interspaced Short Palindromic Repeat (CRISPR) memberi kemampuan kepada para  ilmuwan untuk mengubah sekuens genom pada sebagian besar sel eukariot. Saat ini,  penelitian terkait sistem CRISPR-Cas9 juga berkembang menuju pengembangan sistem represor transkripsional CRISPR interference (CRISPRi) dengan menggunakan sistem dCas9 yang bertujuan untuk mengarahkan rekayasa metabolisme melalui  penyuntingan jalur metabolisme. Saat ini belum banyak penelitian yang memproduksi enzim dCas9 menggunakan metode ekstraseluler yang lebih efisien dan ekonomis. Pada penelitian ini, produksi enzim dCas9 dilakukan secara ekstraseluler dengan menggunakan bakteri Geobacilus kaustophilus dan Escherichia coli BL21 sebagai host dan dipurifikasi dengan menggunakan Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC) dengan penggunaan variasi konsentrasi IPTG, yakni 0,05 mM dan 0,5 mM, dan suhu pemanasan, yakni pada suhu 50oC dan 70EC. Pada suhu pemanasan 50°C dan konsentrasi IPTG 0,5 mM, konsentrasi protein yang didapatkan adalah 1.971 o‡g/mL, sedangkan ketika suhu pemanasan dinaikkan menjadi 70°C konsentrasinya menjadi sebesar 487 o‡g/mL. Pada suhu 50oC, konsentrasi IPTG yang diturunkan menjadi 0,05 mM menghasilkan protein dengan konsentrasi sebesar 281 o‡g/mL. Identifikasi protein dengan uji SDS-PAGE menunjukkan ukuran protein hasil purifikasi sebesar 64,76 kDa.

---

Advancements in genome editing technology using Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat (CRISPR) provide scientists with the ability to modify genome sequences in most eukaryotic cells. Currently, research related to the CRISPR-Cas9 system is also evolving towards the development of the CRISPR interference (CRISPRi) transcriptional repressor system using the dCas9 system, aimed at directing metabolic engineering through pathway editing. At present, there is limited research on producing dCas9 enzymes using a more efficient and economical extracellular method. In this study, dCas9 enzyme production was carried out extracellularly using Geobacillus kaustophilus and Escherichia coli BL21 as hosts and purified using Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC) with variations in IPTG concentrations, namely 0,05 mM and 0,5 mM, and heating temperatures, namely at 50°C and 70°C. At a heating temperature of 50°C and an IPTG concentration of 0,5 mM, the protein concentration obtained was 1,971 μg/mL. When the heating temperature was increased to 70°C, the concentration became 487¼g/mL. At 50°C, lowering the IPTG concentration to 0,05 mM resulted in a protein concentration of 281¼g/mL. Protein identification using SDS-PAGE showed the size of the purified protein to be 64,76 kDa."

"Sistem CRISPR yang semula merupakan mekanisme pertahanan bakteri dapat digunakan sebagai alat rekayasa genetika yang spesifik dan relatif modular, salah satunya adalah CRISPR-dCas9 yang memanfaatkan protein Cas9 dari Streptococcus pyogenes dengan mutasi D10A dan H840A untuk secara spesifik menempel pada sekuens DNA tertentu sehingga menginterferensi ekspresi gen tersebut. Untuk meningkatkan jangkauan aplikasi, diteliti suatu protein dCas9 yang tahan suhu tinggi atau termostabil dari bakteri termofilik Geobacillus kaustophilus, dengan rentang suhu operasi hingga 70 °C, serta ditambatkan protein YebF untuk meningkatkan sekresi ekstraseluler dCas9. Penelitian secara in silico dilakukan dengan Molecular Docking untuk melihat interaksi antara YebF-dCas9 dengan beberapa variasi panjang spacer, repeat, dan tracr sgRNA. Melalui analisis afinitas pengikatan, didapatkan konfigurasi sgRNA optimal adalah dengan panjang spacer 10 nukleotida, repeat 36 nukleotida, dan tracr 63 nukleotida. Uji in vitro dilakukan dengan menganalisis kemampuan YebF-dCas9 menempel pada sekuens gen β-lactamase yang memberikan resistensi ampisilin pada bakteri. Gen penyusun YebF-dCas9 Geobacillus termophilus ditransformasikan ke dalam bakteri E. coli BL21 melalui plasmid rekombinan pET-15b termodifikasi. Hasil protein YebF-dCas9 didapatkan setelah bakteri dikultur dan purifikasi menggunakan Fast Protein Liquid Chromatography. Uji Lowry dilakukan untuk menentukan konsentrasi YebF-dCas9 dalam larutan, sedangkan uji SDS PAGE dilakukan untuk validasi hasil YebF-dCas9 yang diproduksi. Setelah ditransformasikan ke dalam bakteri, struktur YebF-dCas9-gRNA mampu menginhibisi resistensi ampisilin bakteri, menyebabkan menurunnya koloni bakteri yang hidup hingga 98,5%. Digunakan berbagai variasi medium untuk menganalisis pengaruh berbagai ion logam terhadap aktivitas, dengan variasi medium SOC, medium Buffer Taq Polymerase, dan medium air panas Cisolong. Medium transformasi optimal untuk aktivitas YebF-dCas9 adalah medium SOC dengan kadar ion magnesium 486,1 mg/L, kalium 97,74 mg/L, dan natrium 229,89 mg/L.

---

CRISPR system that originated from bacterial defense mechanism can be used as a specific and modular genetic engineering tool, one of which is the CRISPR-dCas9 that utilizes Cas9 protein from Streptococcus pyogenes with D10A and H840A mutation which specifically adheres to certain DNA sequence to interfere the gene expression. To broaden the application scope, a thermostable dCas9 in temperature as high as 70 °C from thermophilic bacteria Geobacillus kaustophilus is isolated, appended with YebF to improve extracellular secretion, and tested. The in silico experiment is done using Molecular Docking to analyze the interaction between YebF-dCas9 and sgRNA with varying spacer, repeat, and tracr length. Using binding affinity analysis, it is found that the optimal configuration for sgRNA to interact with YebF-dCas9 is with 10 nucleotides spacer, 36 nucleotides repeat, and 63 nucleotides tracr. For the in vitro experiment, the ability of YebF-dCas9 is tested, especially the ability to bind with the β-lactamase gene sequence that allows bacteria to have ampicillin resistance. The YebF-dCas9 gene from Geobacillus kaustophilus is transformed into E. coli BL21 bacteria using modified recombinant plasmid pET-15b. Concentrated YebF-dCas9 enzyme is produced after bacterial replication in a liquid culture and protein purification using Fast Protein Liquid Chromatography. Lowry test is performed to determine the YebF0dCas9 concentration, while the SDS PAGE test is performed to validate the produced YebF-dCas9. After transformation to the bacteria, the YebF-dCas9-gRNA structure has the ability to inhibit the ampicillin resistance in bacteria, exhibited by the decrease ini living bacteria colony by up to 98,5%. Various medium are used to study the effect of various metal ions on the activity of YebF-dCas9, using three medium variations of SOC medium, Taq Polymerase Buffer medium, and Cisolong medium. The optimal transformation medium for YebF-dCas9 activity is the SOC medium with magnesium ion concentration of 486.1 mg/L, potassium ion concentration of 97.74 mg/L, and sodium ion concentration of 229.89 mg/L."