Hasil Pencarian  ::  Simpan CSV :: Kembali

"Rekayasa genetika adalah proses yang melibatkan perubahan struktur genetik suatu organisme dengan menghilangkan, memasukkan, atau memodifikasi materi genetik yang terdapat pada objek yang dituju. Salah satu teknik rekayasa genetika adalah pengeditan gen. Metode pengeditan gen yang paling populer saat ini adalah CRISPR-Cas9 yang merupakan singkatan dari clustered regularly interspaced short palindromic repeat-associated protein 9. Penelitian ini mengkaji aktivitas Cas9 dengan sgRNA dari bakteri Geobacillus kaustophilus secara in silico dan in vitro. Pada percobaan in silico digunakan metode molecular docking untuk mengkaji interaksi biomolekuler dengan variasi sgRNA yaitu spacer 10, 20, 30 nt; repeat 16, 25, 36 nt; dan tracrRNA 63, 98, 140 nt. Didapatkan hasil bahwa perubahan panjang spacer, repeat, dan tracrRNA dapat mempengaruhi tingkat besar afinitas pengikatan yang terbentuk dalam kompleks YebF-Cas9-sgRNA dari Geobacillus kaustophilus. Panjang optimal dari hasil molecular docking secara afinitas dan posisi yaitu pada variasi spacer 30 nt dengan repeat 16 nt dan tracrRNA 98 nt serta besar afinitas pengikatan –419,24 kkal/mol. Sedangkan pada percobaan in vitro, enzim Cas9 rekombinan dilakukan fusi enzim pembawa YebF dan diuji aktivitasnya menggunakan metode gel elektroforesis dengan variasi suhu inkubasi pada 30°C dan 50°C serta variasi konsentrasi enzim yaitu 9,4 μM dan 20,1 μM. Dari hasil gel elektroforesis, belum dapat hasil yang signifikan baik dalam uji aktivitas, pengaruh variasi suhu, maupun pengaruh variasi konsentrasi enzim.

---

Genetic engineering is a process that involves changing the genetic structure of an organism by removing, inserting, or modifying genetic material contained in the target object. One of the genetic engineering techniques is gene editing. The most popular gene editing method today is CRISPR-Cas9 which stands for clustered regularly interspaced short palindromic repeat-associated protein 9. This study examines the activity of Cas9 with sgRNA from the bacteria Geobacillus kaustophilus in in silico and in vitro way. In the in silico experiment, the molecular docking method was used to study biomolecular interactions with variations in sgRNA, namely spacer 10, 20, 30 nt; repeat 16, 25, 36 nt; and tracrRNA 63, 98, 140 nt. The results showed that changes in the length of the spacer, repeat, and tracrRNA can affect the level of binding affinity formed in the YebF-Cas9-sgRNA complex from Geobacillus kaustophilus. The optimal length of the molecular docking results in terms of affinity and position is in the variation of 30 nt spacer with 16 nt repeat and 98 nt tracrRNA and the binding affinity is –419.24 kcal/mol. While in the in vitro experiment, the recombinant Cas9 enzyme was fused with the YebF carrier enzyme and its activity was tested using the gel electrophoresis method with variations in incubation temperature at 30°C and 50°C and variations in enzyme concentration (9.4 μM and 20.1 μM). From the results of gel electrophoresis, there are no significant results were obtained in the activity test, the effect of temperature variations, or the effect of enzyme concentration variations."

"Sistem CRISPR yang semula merupakan mekanisme pertahanan bakteri dapat digunakan sebagai alat rekayasa genetika yang spesifik dan relatif modular, salah satunya adalah CRISPR-dCas9 yang memanfaatkan protein Cas9 dari Streptococcus pyogenes dengan mutasi D10A dan H840A untuk secara spesifik menempel pada sekuens DNA tertentu sehingga menginterferensi ekspresi gen tersebut. Untuk meningkatkan jangkauan aplikasi, diteliti suatu protein dCas9 yang tahan suhu tinggi atau termostabil dari bakteri termofilik Geobacillus kaustophilus, dengan rentang suhu operasi hingga 70 °C, serta ditambatkan protein YebF untuk meningkatkan sekresi ekstraseluler dCas9. Penelitian secara in silico dilakukan dengan Molecular Docking untuk melihat interaksi antara YebF-dCas9 dengan beberapa variasi panjang spacer, repeat, dan tracr sgRNA. Melalui analisis afinitas pengikatan, didapatkan konfigurasi sgRNA optimal adalah dengan panjang spacer 10 nukleotida, repeat 36 nukleotida, dan tracr 63 nukleotida. Uji in vitro dilakukan dengan menganalisis kemampuan YebF-dCas9 menempel pada sekuens gen β-lactamase yang memberikan resistensi ampisilin pada bakteri. Gen penyusun YebF-dCas9 Geobacillus termophilus ditransformasikan ke dalam bakteri E. coli BL21 melalui plasmid rekombinan pET-15b termodifikasi. Hasil protein YebF-dCas9 didapatkan setelah bakteri dikultur dan purifikasi menggunakan Fast Protein Liquid Chromatography. Uji Lowry dilakukan untuk menentukan konsentrasi YebF-dCas9 dalam larutan, sedangkan uji SDS PAGE dilakukan untuk validasi hasil YebF-dCas9 yang diproduksi. Setelah ditransformasikan ke dalam bakteri, struktur YebF-dCas9-gRNA mampu menginhibisi resistensi ampisilin bakteri, menyebabkan menurunnya koloni bakteri yang hidup hingga 98,5%. Digunakan berbagai variasi medium untuk menganalisis pengaruh berbagai ion logam terhadap aktivitas, dengan variasi medium SOC, medium Buffer Taq Polymerase, dan medium air panas Cisolong. Medium transformasi optimal untuk aktivitas YebF-dCas9 adalah medium SOC dengan kadar ion magnesium 486,1 mg/L, kalium 97,74 mg/L, dan natrium 229,89 mg/L.

---

CRISPR system that originated from bacterial defense mechanism can be used as a specific and modular genetic engineering tool, one of which is the CRISPR-dCas9 that utilizes Cas9 protein from Streptococcus pyogenes with D10A and H840A mutation which specifically adheres to certain DNA sequence to interfere the gene expression. To broaden the application scope, a thermostable dCas9 in temperature as high as 70 °C from thermophilic bacteria Geobacillus kaustophilus is isolated, appended with YebF to improve extracellular secretion, and tested. The in silico experiment is done using Molecular Docking to analyze the interaction between YebF-dCas9 and sgRNA with varying spacer, repeat, and tracr length. Using binding affinity analysis, it is found that the optimal configuration for sgRNA to interact with YebF-dCas9 is with 10 nucleotides spacer, 36 nucleotides repeat, and 63 nucleotides tracr. For the in vitro experiment, the ability of YebF-dCas9 is tested, especially the ability to bind with the β-lactamase gene sequence that allows bacteria to have ampicillin resistance. The YebF-dCas9 gene from Geobacillus kaustophilus is transformed into E. coli BL21 bacteria using modified recombinant plasmid pET-15b. Concentrated YebF-dCas9 enzyme is produced after bacterial replication in a liquid culture and protein purification using Fast Protein Liquid Chromatography. Lowry test is performed to determine the YebF0dCas9 concentration, while the SDS PAGE test is performed to validate the produced YebF-dCas9. After transformation to the bacteria, the YebF-dCas9-gRNA structure has the ability to inhibit the ampicillin resistance in bacteria, exhibited by the decrease ini living bacteria colony by up to 98,5%. Various medium are used to study the effect of various metal ions on the activity of YebF-dCas9, using three medium variations of SOC medium, Taq Polymerase Buffer medium, and Cisolong medium. The optimal transformation medium for YebF-dCas9 activity is the SOC medium with magnesium ion concentration of 486.1 mg/L, potassium ion concentration of 97.74 mg/L, and sodium ion concentration of 229.89 mg/L."