Hasil Pencarian  ::  Simpan CSV :: Kembali

Abstrak :
Transfeksi merupakan metode penghantaran gen menggunakan vektor nonviral dalam terapi genetika. Kitosan merupakan senyawa alami polimer kationik yang dapat membentuk ikatan ionik dengan molekul DNA yang merupakan polimer anionik sehingga dapat digunakan sebagai penghantar materi genetik. Pada penelitian ini kitosan digunakan sebagai agen penghantar gen pengkode Green Fluorescence Protein (GFP) dari plasmid pCSII-EF-AcGFP yang ditransfeksikan pada sel primer peritoneal, sel splenosit, serta galur sel HEK293T. Tujuan penelitian ini untuk mengetahui kemampuan kitosan dalam mengompleks dan melindungi DNA terhadap degradasi enzim DNAse. Selain itu, uji transfeksi dan uji sitotoksisitas kitosan dilakukan untuk mengetahui sifat dan kemampuan kitosan sebagai agen penghantar pada sel peritoneal, sel splenosit, dan galur sel HEK293T. Hasil penelitian menunjukkan bahwa kitosan mampu mengompleks dan melindungi DNA terhadap degradasi enzim DNAse. Hasil uji sitotoksik menggunakan MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5 diphenyl tetrazolium bromide) terhadap sel peritoneal, sel splenosit, dan galur sel HEK293T relatif tidak toksik, pada konsentrasi kitosan 8 g/L menunjukkan viabilitas sel berturut-turut sebesar 64% (sel peritoneal), 80% (sel splenosit), dan 70% (galur sel HEK293T). Kitosan secara kualitatif dapat memfasilitasi ekspresi gen pengkode Green Fluorescent Protein (GFP) pada galur sel HEK293T, meskipun intensitas ekspresi gen GFP tidak lebih terang daripada agen transfeksi komersil Lipofectamine® 3000. Akan tetapi, pembanding Lipofectamine maupun kitosan belum berhasil memfasilitasi ekspresi gen GFP yang ditunjukkan dengan tidak adanya pendaran cahaya pada sel peritoneal dan sel splenosit meskipun rasio perbandingan massa kitosan dan Lipofectamine telah ditingkatkan dari 1:2 menjadi 1:4 selama inkubasi 2x24 jam. Modifikasi struktur atau formulasi kitosan yang tepat diperlukan untuk meningkatkan kemampuan senyawa kitosan dalam memfasilitasi ekspresi gen GFP pengkode plasmid pCSII-EF-AcGFP ke dalam sel peritoneal dan splenosit. ......Transfection is a gene delivery method using nonviral vectors in genetic therapy. Chitosan is a natural cationic polymer compound that can form ionic bonds with DNA molecules which are anionic polymers so that it can be used as a conductor of genetic material. In this study, chitosan was used as a delivery agent for the gene encoding Green Fluorescence Protein (GFP) from the pCSII-EF-AcGFP plasmid which was transfected on peritoneal primary cells, splenocytes, and HEK293T cell lines. The purpose of this study was to determine the ability of chitosan to form complexes and protect DNA against DNAse enzyme degradation. In addition, chitosan transfection and cytotoxicity tests were carried out to determine the nature and ability of chitosan as a conducting agent in peritoneal cells, splenocytes, and HEK293T cell lines. The results showed that chitosan was able to complex and protect DNA against DNAse enzyme degradation. The results of the cytotoxic test using MTT (3[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5 diphenyl tetrazolium bromide) against peritoneal cells, splenocytes, and HEK293T cell lines were relatively non-toxic, at a concentration of 8 g/L chitosan showed cell viability was 64% (peritoneal cells), 80% (splenocyte cells), and 70% (HEK293T cell line). Chitosan can qualitatively facilitate the expression of the gene encoding Green Fluorescent Protein (GFP) in the HEK293T cell line, although the intensity of GFP not brighter than that of the commercial transfection agent Lipofectamine® 3000. However, neither Lipofectamine nor chitosan comparisons have been GFP showing the absence of light luminescence in peritoneal cells and splenocytes cells although the ratio of mass ratio of chitosan and Lipofectamine has been increased from 1:2 to 1:4 during 2x24 hours incubation. Modification of the structure or proper formulation of chitosan is needed to increase the ability of chitosan compounds to facilitate the expression of the GFP encoding the plasmid pCSII-EF-AcGFP into peritoneal cells and splenocytes.

Abstrak :
Agen pembawa materi genetik atau vektor berperan penting dalam mekanisme penghantaran gen. Vektor non-viral seperti liposom merupakan alternatif yang menjanjikan karena memiliki imunogenisitas yang lebih rendah daripada vektor viral. Namun, instabilitas dan rendahnya ekspresi gen merupakan tantangan utama dari penghantaran gen menggunakan vektor non-viral. Penggunaan polimer kationik polietilenimin (PEI) dengan berat molekul tinggi seperti PEI-25.000 efektif dalam menghasilkan ekspresi gen yang tinggi, tapi bersifat toksik terhadap sel. Maka dari ituOleh karena itu, formulasi liposom berbasis PEI yang memiliki berat molekul rendah diperlukan untuk meningkatkan efektivitasnya sebagai agen transfeksi. Pada penelitian ini, digunakan PEI bercabang dengan berat molekul 800 Da (PEI-800) yang diformulasikan dengan kolesterol dan Tween menjadi liposom dengan PEI-800 dan PEI-25.000 sebagai kontrol pembanding. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui kemampuan kompleks DNA-liposom berbasis PEI-800 dan kolesterol (1:0,5; 1:1; 1:2; 1:3; 1:4) dalam mengkondensasi dan melindungi materi genetik dari degradasi enzim, efektivitas liposom sebagai agen transfeksi pada galur sel Human Embryonic Kidney (HEK-293T), dan toksisitas liposom terhadap galur sel HEK-293T. Liposom dipreparasikan dengan metode dispersi etanol dan kompleks DNA-liposom dikarakterisasi secara lebih lanjut untuk mengetahui mobilitas, stabilitasnya terhadap degradasi enzim, dan kemampuannya mengkondensasi DNA. Liposom juga dievaluasi secara in vitro dengan uji MTT untuk mengetahui tingkat sitotoksisitasnya dan digunakan untuk transfeksi gen pengode Green Fluorescence Protein (GFP) pada galur sel HEK-293T untuk mengetahui efektivitas transfeksinya. Kompleks DNA-liposom dengan perbandingan 1:2 sampai 1:4 terhadap DNA mampu mengkondensasi DNA dan melindungi DNA dari degradasi enzim DNAse secara sempurna sehingga tidak terbentuk pita DNA pada gel elektroforesis. Liposom yang diformulasikan tidak mampu mengekspresikan GFP dengan baik pada galur sel HEK-293T, tapi bersifat non-toksik, yaitu menunjukkan ≥70% viabilitas sel. Liposom berbasis polimer kationik PEI-800 yang diformulasikan dengan kandungan kolesterol yang tinggi (10 µmol) dan Tween lebih efektif dalam mengkondensasi DNA dibandingkan kontrol. Karakterisasi kompleks DNA-liposom perlu dilakukan lebih lanjut dengan menentukan ukuran partikel dan zeta potensial. Evaluasi secara in vitro kompleks DNA-liposom juga perlu dilakukan pada galur sel mamalia lain dan secara in vivo untuk mengetahui efektivitasnya. ......Gene delivery vehicles or vectors play a very important role in the mechanism of delivery. Non-viral vectors such as liposomes are promising alternatives to viral vectors because they are less imunogenic. However, instability and low expression are the major challenges in gene delivery using non-viral vectors. The use of cationic polymer polyethyleneimine (PEI) with high molecular weight like PEI-25.000 is effective in resulting high gene expression, but is toxic to the cells. Therefore, formulations of cationic polymer PEI with low molecular weight are needed to increase the efficiency. In this study, branched polyethyleneimine with molecular weight of 800 Da (PEI-800) that is formulated with cholesterol and Tween as cationic polymer based liposome, and PEI-800, PEI-2500 is used to as controls. This study aims to understand the ability of PEI-800 and cholesterol-based liposome complexes with DNA (1:0,5; 1:1; 1:2; 1:3; 1:4) in condensing and protecting genetic materials from enzyme degradation, efficiency of liposomes as transfection agents in Human Embryonic Kidney (HEK-293T) cell lines, and the toxicity of liposomes to HEK-293T cell lines. Liposomes were prepared using ethanol dispersion method and DNA-liposomes complexes were further characterized for their mobility, stability against enzyme degradation, and the ability to condense DNA. Liposomes are also evaluated in vitro for the cytotoxicity using MTT assay and are used to transfect Green Fluorescent Protein (GFP) encoding gene to HEK-293T cell lines to know their transfection efficiency. DNA-liposomes complexes with 1:2 to 1:4 ratio were able to condense DNA and protect DNA against the degradation of DNAse effectively. Although DNA-liposomes complexes resulted in low expression of GFP in HEK-293T cell lines, liposomes were non-toxic, showing ≥70% cell viability. Liposomes with higher cholesterol content (10 µmol) and presence of Tween are more effective in condensing DNA than controls. Further characterization of DNA-liposome complexes’, particle size and zeta potential for instance is needed. In vitro evaluation in other mammalian cell lines and in vivo evaluation are needed to further determine the efficiency of low molecular weight PEI based liposomes.