Hasil Pencarian  ::  Simpan CSV :: Kembali

Abstrak :
Filtrat biakan yang diperoleh dlpekatkan, kemudian dilakukan pengujian anatisa karakterisasinya. Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi dan mengkarakterisasr enzim a-amilase ekstraseluler yang dihasilkan dari isolat bakteri SW2. Isolasi dilakukan setelah bakteri tersebut difermentasi pada media pati kentang selama 39 jam pada temperatur 60°C, pH 7,5 di dalam shaker incubator yang berkecapan 150 rpm. Uji karakterisasi enzim meliputi; penentuan temperatur dan pH optimum, penentuan stabilitas i' termal enzim, penentuan aktivator dan inhibitor, penentuan berat molekul, pengaruh penyimpanan terhadap stabilitas enzim serta penentuan produk hidrolisis substrat yang dikatalisis enzim. Enzim a-amilase yang diperoleh memiliki aktivitas optimum pada temperatur 70°C dan pH 6,0. Enzim tersebut merupakan a-amilase logam yang bersifat termofil dan termostabil. Ion logam yang meningkatkan aktivitas enzim adalah Na"^, \C, Ca^* dan Mn^"^ sedangkan ion logam yang menghilangkan aktivitas enzim adalah Ni^"^, Zn^* dan Fe^"^, aktivitas enzim berkurang dengan adanya SDS dan urea. Berat molekul enzim kasar a-amilase ekstraseluler SW2 diperkirakan sekitar 180 kDa. Reaksi hidrolisis yang dikatalisis a-amilase ini pada berbagai polisakarida menghasilkan produk utama G1, G2, G3, G4 dan cabang dekstrin. Uji stabilitas, terhadap penyimpanan selama 4 bulan, menunjukkan aktivitas enzim mengalami penurunan sebesar ±29% bila disimpan pada temperatur 4°C dan penurunan sebesar ±50% bila disimpan pada temperatur 30°C.

Abstrak :
Enzim Cas9 merupakan bagian dari CRISPR-Cas9 yang berperan sebagai endonuklease untuk memotong DNA/RNA pada sekuens yang spesifik. Enzim Cas9 berguna dalam bidang kesehatan, pangan, dan industri. Namun, banyak industri yang beroperasi pada suhu tinggi sehingga enzim Cas9 pada umumnya tidak dapat digunakan dan diperlukan enzim Cas9 yang termostabil. Akan tetapi, belum banyak penelitian mengenai jenis enzim Cas9 termostabil. Oleh sebab itu, mengetahui adanya Cas9 pada isolat lokal Geobacillus kaustophilus TBUI01, dilakukan produksi enzim Cas9 dengan teknik rekombinan pada Escherichia coli BL21. Enzim Cas9 kemudian dipanaskan untuk menghilangkan semua protein mesofilik dari Escherichia coli BL21 pada suhu 50oC, 60oC, dan 70oC. Lalu dipurifikasi dengan teknik presipitasi amonium sulfat dengan variasi fraksinasi 20%, 50%, dan 80%. Sampai saat ini, belum ada penelitian enzim Cas9 tahan panas yang menggunakan presipitasi amonium sulfat sebagai satu-satunya teknik purifikasi. Teknik ini dilakukan karena ekonomis, cepat, dan juga mudah dilakukan. Hasil menunjukkan bahwa suhu pemanasan 60 oC adalah suhu yang optimal untuk mendegradasi protein mesofilik tanpa mendegradasi enzim Cas9. Presipitasi amonium sulfat optimal dilakukan pada fraksinasi 50% karena mampu mempresipitasi enzim Cas9. Akan tetapi, masih ada protein lain yang berhasil dipresipitasi sehingga presipitasi amonium sulfat dapat dijadikan sebagai langkah purifikasi awal untuk mengonsentrasikan protein. ......The Cas9 enzyme is part of CRISPR-Cas9 which acts as an endonuclease to cut DNA/RNA in specific sequences. Cas9 is useful in the fields of health, food, and industry. However, many industries operate at high temperatures so that Cas9 enzymes generally cannot be used and a thermostable Cas9 enzyme is needed. Nevertheless, there has not been much research on the type of thermostable Cas9 enzyme. Therefore, knowing the presence of Cas9 in the local isolate Geobacillus kaustophilus TBUI01, Cas9 enzyme production was carried out using recombinant techniques on Escherichia coli BL21. The Cas9 enzyme was then heated to remove all mesophilic protein from Escherichia coli BL21 at 50oC, 60oC and 70oC. Then it was purified by ammonium sulfate precipitation technique with 20%, 50% and 80% saturation. Until now, there has been no research on thermostable Cas9 using ammonium sulfate precipitation as the only purification technique. This technique is done because it is economical, fast, and easy to do. The result showed that a heating temperature of 60oC is the optimal temperature for degrading mesophilic proteins without degrading Cas9 enzymes. Optimal ammonium sulfate precipitation is carried out at 50% fractionation because it can precipitate the Cas9 enzyme. However, there are still other proteins that have been successfully precipitated so that the precipitation of ammonium sulfate can be used as an initial purification step to concentrate protein.

Abstrak :
Sistem CRISPR-Cas9 merupakan mekanisme perlindungan bakteri terhadap materi genetik asing yang diaplikasikan secara luas dalam rekayasa genetika. Kombinasi enzim Cas9 dengan gRNA pada CRISPR-Cas9 memungkinkan terjadinya pengeditan genom terhadap target yang spesifik. Meskipun demikian, Cas9 yang dikembangkan saat ini berasal dari bakteri mesofilik sehingga rentan terdegradasi dan tidak cocok untuk aplikasi pada temperatur tinggi. Di sisi lain, bakteri termofilik Geobacillus kaustophilus telah diisolasi dari mata air panas di Cisolong, Banten, dan diidentifikasi mengandung enzim Cas9. Untuk memperoleh enzim Cas9 yang tidak terdenaturasi pada temperatur tinggi (termostabil), dilakukan uji coba produksi Cas9 rekombinan dari Geobacillus kaustophilus. Gen Cas9 yang telah dikloning pada plasmid pET43.1a ditransformasikan ke dalam Escherichia coli BL21 dan dikultur dengan konsentrasi penambahan IPTG yang bervariasi—0,05 mM, 0,20 mM, dan 0,50 mM. Hasil kultur bakteri dipanaskan pada temperatur yang bervariasi (50 °C, 60 °C, dan 70 °C) untuk mendenaturasi enzim non-termofilik. Setelah itu, sampel dipurifikasi dengan mmobilized Metal Affinity Chromatography untuk memperoleh enzim Cas9. Hasil uji Lowry menunjukkan sampel heated supernatant dengan konsentrasi IPTG 0,05 mM dan temperatur pemanasan 50 °C memiliki konsentrasi protein tertinggi dan hasil purifikasinya memiliki konsentrasi Cas9 sebesar 42,6 μg/mL. Identifikasi protein dengan uji SDS-PAGE menunjukkan ukuran protein hasil purifikasi sebesar 52,61 kDa. ......The CRISPR-Cas9 system is a bacterial defense mechanism against foreign genetic material that is broadly applied in genetic engineering. The combination of Cas9 enzyme and gRNA in CRISPR-Cas9 allows genome editing of specific targets. However, the currently developed Cas9 originated from mesophilic bacteria, making it susceptible to degradation and unsuitable for applications requiring elevated temperatures. On the other hand, the thermophilic bacterium, Geobacillus kaustophilus, was isolated from a hot spring in Cisolong, Banten, and identified as containing the Cas9 enzyme. To obtain undenatured Cas9 enzymes at high temperatures (thermostable), a production test of recombinant Cas9 from Geobacillus kaustophilus was carried out. The Cas9 gene cloned on the pET43.1a plasmid was transformed into Escherichia coli BL21 and cultured under various IPTG addition concentrations—0.05 mM, 0.20 mM, and 0.50 mM. The bacterial cultures were heated at various temperatures (50 °C, 60 °C, and 70 °C) to denature unwanted non-thermophilic enzymes. Thereafter, the samples were purified using Immobilized Metal Affinity Chromatography to obtain Cas9 enzyme. Lowry protein assay results showed that the heated supernatant sample with 0.05 mM IPTG addition and 50 °C heating temperature has the highest protein concentration, and the purified sample yielded a Cas9 concentration of 42.6 μg/mL. Protein identification with SDS-PAGE revealed a purified protein size of 52.61 kDa

Abstrak :
Indonesia memiliki ketergantungan terhadap impor kit untuk Polymerase Chain Reaction (PCR). Salah satu komponen krusial dalam PCR adalah DNA polimerase termostabil. Hal ini tidak sebanding dengan Indonesia yang terletak pada Ring of Fire, dimana Indonesia memiliki potensi ekosistem geothermal yang besar sebagai habitat bakteri termofilik penghasil DNA polimerase termostabil. Gen DNA pol I lokal dari Geobacillus thermoleovorans Batu Kuwung, Banten, telah berhasil dikloning pada plasmid pET-15b dan ditransformasikan pada Escherichia coli BL21. Meskipun GBK pol memiliki peran yang sangat penting dalam amplifikasi isothermal yang menjadikannya dapat diaplikasikan dalam PCR, untuk dapat memproduksi GBK pol secara komersil masih dinilai kurang layak secara ekonomi. Penelitian yang telah dilakukan untuk GBK pol masih memiliki keterbatasan dalam optimalisasi dan produksi scale-up. Oleh karena itu, pada penelitian ini dilakukan optimasi kondisi ekspresi seperti: kecepatan agitasi, waktu inkubasi setelah induksi, volume kerja dan peningkatan skala produksi pada 7,5 L bioreaktor untuk meningkatkan efisiensi, produksi dan ekspresi. Pada penelitian ini didapatkan kondisi optimum pada kecepatan agitasi 200 rpm, waktu inkubasi setelah induksi 4 jam dan 20% volume kerja. Selain itu, pada penelitian ini berhasil dilakukan produksi GBK pol pada 7,5 L bioreaktor dan menghasilkan konsentrasi protein tertinggi sebesar 0,042 µg/µL dengan waktu optimum untuk inkubasi setelah induksi selama 3 jam. ......Indonesia relies on imported kits for Polymerase Chain Reaction (PCR). In fact, one of the crucial components in PCR is thermostable DNA polymerase. This is not comparable to Indonesia’s potential which is located on the Ring of Fire. Consequently, Indonesia holds the potential for a large geothermal ecosystem which serves as a habitat for thermophilic bacteria capable of producing thermostable DNA polymerase. The local DNA pol I gene from Geobacillus thermoleovorans Batu Kuwung, Banten, has been successfully cloned into the plasmid pET-15b and transformed into Escherichia coli K pol in isothermal amplification, making it applicable for PCR, the commercial production of GBK pol is still considered economically unfeasible. The research conducted for GBK pol still has limitations in optimization and scale-up production. Therefore, in this study optimization of expression conditions was carried out, including the speed of agitation, post-induction incubation time, working volume and scale-up production at 7,5 L bioreactor to increase efficiency, production, and expression. In this study, the optimum conditions were obtained at an agitation speed of 200 rpm, a post-induction incubation time of 4 hours and 20% working volume. Furthermore, the production of GBK pol was successfully carried out in a 7.5 L bioreactor, resulting in the highest protein concentration of 0.042 µg/µL with the optimum post-induction incubation time for 3 hours.