Hasil Pencarian  ::  Simpan CSV :: Kembali

Abstrak :

Imunoterapi merupakan metode terapi kanker yang sedang berkembang namun belum tersedia bebas di Indonesia karena biayanya yang mahal. Salah satu cara kerjanya adalah dengan menargetkan bagian spesifik dari sistem imun untuk membentuk respon terhadap sel ganas dan meningkatkan apoptosis sel menggunakan antibodi monoklonal. Contohnya reseptor PD1 yang berfungsi untuk menghalangi ligan PD1 yang banyak terdapat pada permukaan sel kanker. Riset ini bertujuan untuk mendapatkan plasmid rekombinan epitop PD1 EP2 yang akan dipergunakan dalam riset payung tim PRVKP. Rekombinasi DNA dilakukan dengan memasukan fragmen DNA PD1 EP2 yang telah diperbanyak dan dipotong ke dalam plasmid pQE-80L. Hasil ligasi kemudian ditransformasi dalam bakteri E.coli TOP10 dan dianalisa dengan PCR koloni. Produk PCR terbukti mengandung plasmid rekombinan PQE EP2. Konfirmasi selanjutnya dengan analisa sekuens DNA memastikan kandungan basa pada fragment insert telah terekspresi dalam plasmid. Sekuensing koloni ke 12 menunjukan bahwa insert telah terekspresi tanpa mutasi. Beberapa protokol ditemukan berpotensi mengurangi kemungkinan keberhasilan studi ini namun penelitian lebih lanjut. Dikarenakan hasil analisa ulang situs restriksi HindIII pada sekuens DNA tidak dapat memberi kepastian, sekuensing ulang disarankan untuk dilakukan. Protokol PRVKP disarankan untuk disempurnakan kembali.

---

Immunotherapy is a flourishing method for cancer treatment that is not available in Indonesia due to its expensive cost. One of its working method is by targeting a specific part of immune system to induce response against cancer cell and increase cell apoptosis with monoclonal antibodies. As example, PD1 receptor which function is to inhibit PD1 ligands abundantly found at the surface of cancer cell. This research focused on obtaining PD1 EP2 epitope recombinant plasmid to create the PD1 monoclonal antibody that is being develop by PRVKP team. DNA recombination was performed by inserting PD1 EP2 epitope's fragment into pQE-80L plasmid. Ligation product was then transformed into E.coli TOP10 bacteria and analyzed with colony PCR. PCR product had been proven to yield several colonies which contain PQE EP2 recombinant plasmid. Next, sequence analysis was conducted to confirm correct insert fragment was successfully expressed in plasmid. The 12th colony sequence was confirmed to contain non-mutated bases. Several protocol were found to potentially decrease the chance of success, yet further examination was not executed as it was not the focus of the research. As reanalysis of HindIII restriction site in recombinant sequence remained inconclusive, resequencing was suggested. PRVKP protocols adjustment was advised.

Abstrak :
Latar Belakang: gp41 adalah transmembran glikoprotein yang memiliki peran penting dalam fusi dan masuknya Human Immunodeficiency Virus-1 (HIV-1). Keterlibatan protein transmembrane gp41 sangatlah krusial di seluruh fase awal penularan mukosa HIV-1; maka keberadaan protein ini penting untuk skrining dan diagnosis HIV-1. Protein transmembran gp41 dapat dimanfaatkan sebagai alat diagnostik HIV-1 melalui uji deteksi antibodi yang meliputi, Rapid Diagnostic Test, ELISA, dan Western Blot (WB). Namun, meskipun terdaftar sebagai salah satu protein HIV-1 yang memiliki banyak manfaat, studi mengenai ekspresi dan optimalisasi protein transmembran gp41 masih kurang diteliti. Oleh karena itu, penelitian ini bertujuan untuk memperoleh pengetahuan mengenai kondisi optimal untuk mengekspresikan protein transmembran gp41 pada Escherichia coli (E. coli) PQE80L untuk pengembangan uji diagnostik HIV-1. Metode: Penelitian ini menggunakan bagian imunodominan dari protein transmembrane gp41 (gp41-IDR). Protein gp41-IDR kemudian diekspresikan dalam sistem ekspresi E. coli dan dioptimalkan pada berbagai variabel, yaitu media kultur, konsentrasi penginduksi dan waktu induksi. Hasil yang diperoleh dari SDS-PAGE 20% didokumentasikan oleh ImageQuant Las 4000, sedangkan kuantisasi dan analisa protein gp41-IDR dilakukan di Image Lab 6.1. Software for Mac. Hasil: Hasil penelitian menunjukkan bahwa protein gp41-IDR lebih maksimal jika diekspresikan pada medium Terrific Broth (TB) dibandingkan dengan dua media kaya nutrisi lainnya, yaitu Luria Bertani (LB) dan 2x Yeast Extract-Tryptone (2x YT). Di antara lima konsentrasi Isopropil-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) yang diuji, induksi oleh 1 mM IPTG menunjukkan hasil protein tertinggi jika dibandingkan dengan konsentrasi IPTG lainnya. Apabila dibandingkan dengan protein yang diinduksi selama 6 jam dan semalam, induksi protein gp41-IDR rekombinan selama 3 jam menunjukkan hasil protein tertinggi. Kesimpulan: Protein rekombinan gp41-IDR HIV-1 berhasil diekspresikan pada Escherichia coli (E. coli), dengan PQE80L sebagai vektor ekspresi. Hasil dari penelitian ini menunjukkan bahwa protein rekombinan gp41-IDR dari HIV-1 Subtipe CFR01_AE diekspresikan secara optimal pada medium Terrific Broth (TB), dengan 1 mM IPTG selama 3 jam. ......Background: gp41 is a viral transmembrane glycoprotein that plays a significant role in the fusion and entry of Human Immunodeficiency Virus-1 (HIV-1). The involvement of gp41 transmembrane protein is pivotal throughout the early phases of HIV-1 mucosal transmission; hence the presence of this protein is important for HIV-1 screening and diagnosis. gp41 transmembrane protein can be utilized as an HIV-1 diagnostic tool through antibody detection tests, namely Rapid Diagnostic Test, ELISA, and Western Blot (WB). However, despite being listed as one of the most valuable HIV-1 proteins, research regarding the expression and optimization of gp41 transmembrane protein is likely underreported. Therefore, this research aims to obtain knowledge regarding the optimal condition to express gp41 transmembrane protein in Escherichia coli (E. coli) PQE80L for the development of HIV-1 diagnostic test. Methods: The immunodominant region of gp41 transmembrane protein (gp41-IDR) was used in this study. gp41-IDR protein was expressed in E. coli expression system and optimized under varying variables, namely culture medium, inducer concentration and induction time. The results obtained from SDS-PAGE 20% were documented by ImageQuant Las 4000, while quantitation and analysis of the gp41-IDR protein was done in Image Lab 6.1. Software for Mac. Results: The results indicated that the gp41-IDR protein yield was maximized when expressed in Terrific Broth (TB) Medium as compared to other two nutrient-rich media, namely Luria Bertani (LB) and 2x Yeast Extract-Tryptone(2x YT). Among the five Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) concentrations tested, induction by 1 mM of IPTG showed the highest protein yield when compared to the other IPTG concentrations. In comparison to those induced for 6 hours and overnight, induction of recombinant gp41-IDR protein for 3 hours offered the highest protein yields. Conclusion: To conclude, recombinant gp41-IDR HIV-1 protein was successfully expressed in the Escherichia coli (E. coli) host system, with PQE80L as expression vector. Findings from this study indicate that gp41-IDR recombinant protein from HIV-1 Subtype CFR01_AE is optimally expressed in Terrific Broth (TB) Medium, with 1 mM of IPTG for 3 hours.

Abstrak :
Gen pol murine leukemia virus adalah gen pengkode enzim reverse transcriptase (RT) yang berfungsi untuk mentranskripsi balik genom RNA virus menjadi DNA. Enzim RT banyak digunakan sebagai komponen dalam RT-PCR untuk mensintesis cDNA dari RNA. Penelitian bertujuan mengekspresikan gen pol MLV dan mengetahui fungsi enzim RT yang dihasilkan. Gen pol MLV dalam penelitian sebelumnya, telah dikonstruksi tidak memiliki sekuen pengkode asam amino RNase H dan berhasil ditransformasi ke dalam Escherichia coli BL21. Eskpresi gen pol dilakukan menggunakan induksi IPTG 0,3 mM. Hasil penelitian menunjukkan bahwa gen pol MLV telah berhasil diekspresikan dan menghasilkan enzim RT tanpa RNase H dengan berat molekul ~58 kDa. Enzim RT selanjutnya dipurifikasi menggunakan resin Ni-NTA dan dilakukan pengujian fungsi enzim tersebut dengan RT-PCR. Hasil analisis menunjukkan bahwa enzim RT dalam penelitian terbukti dapat berfungsi mensintesis cDNA menggunakan cetakan RNA pada proses RT-PCR.

Abstrak :
Keamanan dari vaksin terapetik untuk kanker serviks yang didasarkan pada antigen HPV E6 perlu dipastikan dengan uji interaksi antara vaksin dan protein p53. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mendapatkan plasmid rekombinan untuk ekspresi protein rekombinan p53 yang akan digunakan dalam uji interaksi. Enzim RevertAid dan primer random hexamer digunakan untuk mendapatkan cDNA dari sel HeLa yang akan digunakan sebagai cetakan PCR dengan menggunakan enzim Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity dan primer p53 spesifik. Produk PCR yang dihasilkan sebesar 1204 bp yang mengandung gen p53 dengan adanya penambahan situs restriksi endonuklease SalI dan PstI. Setelah pemotongan dengan enzim SalI dan PstI, produk PCR diligasi dengan plasmid pQE-80L yang juga sudah dipotong dengan enzim yang sama. Campuran ligasi digunakan untuk transformasi ke dalam Escherichia coli TOP10. Keberadaan fragmen DNA p53 yang berhasil dimasukkan ke dalam plasmid rekombinan yang sudah berada di dalam transforman diverifikasi menggunakan PCR, pemotongan DNA rekombinan, dan sekuensing. Hasil penelitian menunjukkan bahwa gen p53 manusia berhasil diklon ke pQE-80L dengan adanya mutasi pada urutan basa nukleotida ke-386.

---

In order to confirm the safety of a therapeutic vaccine for cervical cancer that is based on HPV E6 antigen, an interaction assay between the vaccine and the p53 protein is required. The aim of this study is to obtain a recombinant plasmid for expression of p53 recombinant protein that will be used in the interaction assay. The RevertAid enzyme and random hexamer primer was employed to obtain cDNA from HeLa cell that will be used as template in PCR using the Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity enzyme and p53 specific primer set, to generate a 1204 bp PCR product containing the p53 gene, with flanking SalI and PstI endonuclease restriction sites. Following restriction with SalI and PstI enzyme, the PCR product was ligated with the plasmid pQE 80L that has been linearized by restriction with the same enzymes. The ligation mixture was used for transformation of Escherichia coli TOP10. The presence of the inserted p53 DNA fragment in the recombinant plasmid harboured by the transformants was verified using PCR, digestion of recombinant plasmids, and sequencing. The results showed that the human p53 gene was successfully cloned into pQE 80L with a mutation at position 386 of the p53 nucleotide base sequence.

Abstrak :
ABSTRAK
Salah satu permasalahan yang dihadapi oleh pengobatan regeneratif menggunakan sel punca adalah metode verifikasi sifat pluripotensi terhadap sel punca yang telah diperoleh. Verifikasi sifat pluripotensi dilakukan dengan menggunakan antibodi untuk mengenali protein marka sel punca yang dihasilkan oleh sel tersebut. Penelitian ini bertujuan untuk mengekspresikan dan mempurifikasi salah satu protein marka sel punca, yaitu SOX2 sehingga dapat digunakan untuk memproduksi antibodi yang dapat digunakan untuk proses verifikasi tersebut. Ekspresi protein SOX2 dilakukan pada sistem ekspresi Escherichia coli BL21 codon plus dengan menggunakan plasmid rekombinan pQE-80L Sox2, kemudian protein SOX2 diverifikasi secara kualitatif dengan menggunakan SDS-PAGE dan Western blot. Hasil menunjukkan bahwa SOX2 telah berhasil diekspresikan pada sistem ekspresi yang digunakan, namun kodon gen sintetik Sox2 yang belum teroptimasi untuk beradaptasi pada sistem ekspresi menyebabkan jumlah protein yang dihasilkan sedikit. Purifikasi SOX2 juga telah berhasil dilakukan dengan menggunakan sistem purifikasi Ni-NTA dalam keadaan terdenaturasi.

---

ABSTRACT
One of the problems faced by the use of stem cells in regenerative medicine is to find a proper method for verifying the pluripotency of a stem cell obtained. Verification of the cell pluripotency can be accomplished by using an antibody to identify the stem cell protein marker produced by the cell. The purpose of this research is to express and purify one of the stem cell marker protein, SOX2, in order to produce the antibody that can be used in the verification process. SOX2 protein expression was acomplished by using Escherichia coli BL21 codon plus expression system as host with pQE 80L Sox2 recombinant plasmid. The protein SOX2 obtained then was qualitatively verified by using SDS PAGE and Western blotting. Result showed that SOX2 has been successfully expressed by the expression system used. However, the unoptimized codon of the synthetic Sox2 gene causing the codon unable to adapt properly to the expression system, therefore may affect the translation process and lower the protein yield. Purification of SOX2 protein was also has been successfully conducted by using Ni NTA purification system in denatured protein condition.

Abstrak :
Protein pol termasuk dalam tiga gen signifikan yang mengkode protein struktural HIV-1. Namun, sebagian besar tes diagnostik HIV hanya melibatkan dua produk HIV yang signifikan yaitu, protein Env atau Gag, yang berarti bahwa sebagian besar tes diagnosa HIV dilakukan atau dikembangkan menggunakan antigen yang sama. Hal ini pada akhirnya dapat menghasilkan hasil positif palsu yang berulang jika ada antibodi yang bereaksi silang karena sebagian besar tes disiapkan hanya dengan antigen umum yang sama. Solusi untuk masalah ini adalah mengembangkan uji diagnostik alternatif yang berbeda menggunakan antigen utama lain, seperti protein Pol. Salah satu produk protein Pol, enzim Integrase, termasuk dalam salah satu protein imunogenik HIV, yang berarti dapat digunakan untuk meningkatkan spesifisitas tes diagnostik HIV. Menggunakan protein Pol Immunodominant 2 (Pol ID2), sebuah protein yang terdiri dari Integrase dan RNAse H, yang sudah dikembangkan sebelumnya menggunakan subtipe HIV-1 yang paling menonjol di Indonesia (HIV-1 CRF01_AR), penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan pengetahuan tentang kondisi optimal untuk mengekspresikan protein rekombinan Pol ID2 dalam plasmid pQE-80L Escherichia coli (E. coli) dengan harapan dapat berkontribusi terhadap pengembangan dan peningkatan kemandirian tes diagnostik HIV-1 di Indonesia. Metode: Penelitian ini dilakukan menggunakan metode desain studi eksperimental analitik. Dalam penelitian ini, protein rekombinan Pol Immunodominant 2 (ID2) dalam plasmid pQE-80L E. coli diekspresikan pada beberapa variabel media kultur, konsentrasi penginduksi, dan waktu induksi. Kultur ekspresi divisualisasikan menggunakan elektroforesis SDS PAGE dan didokumentasikan menggunakan mesin ImageQuant Las 4000. Meskipun tidak ada analisis statistik yang dilakukan, software analisis gel Image Lab 6.1 digunakan untuk menganalisis, mengukur, dan mendapatkan rasio kuantitas absolut dari konsentrasi protein pada setiap variabel. Hasil: Protein rekombinan Pol ID2 yang diperoleh dari HIV-1 subtipe CFR01_AE dapat diekspresikan secara optimal menggunakan media Terrific Broth dengan menggunakan 1mM Isopropil- beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) selama 3 jam induksi. Kesimpulan: Dapat disimpulkan bahwa plasmid pQE80L-Pol ID2 yang sebelumnya sudah dikembangkan di laboratorium PRVKP FKUI-RSCM dapat mengekspresikan protein rekombinan Pol ID2 dari HIV-1 subtipe CFR01_AR yang dikembangkan di bawah laboratorium yang sama. Protein dapat diekspresikan secara optimal dalam media kultur Terrific Broth menggunakan IPTG 1mM selama 3 jam induksi pada suhu 37oC. ......Background: Pol protein is included in the three significant genes that encode a structural protein of HIV-1. However, most HIV diagnostic tests involve only the two significant HIV products, Env or Gag protein, which means that most manufacturers use the same antigen sequence to develop these tests. This may eventually result in repetitive false-positive results if there is any cross-reacting antibody since the test is prepared only with the same common antigens. A solution to this problem is developing a different alternative diagnostic assay using a different major antigen such as Pol genes. One of the Pol gene products, viral enzyme integrase, is included in one of the immunogenic proteins of HIV, meaning that it may be used to improve the specificity of HIV diagnostic assays. Using a previously generated Pol Immunodominant 2 (Pol ID2) protein, comprised of Integrase and RNAseH, obtained from the most prominent HIV-1 subtype in Indonesia (HIV-1 CRF01_AR), this research aims to gain knowledge regarding the optimal conditions to express Pol ID2 recombinant protein in pQE-80L plasmid of Escherichia coli (E. coli) in hopes to contribute towards the development and self-reliance of HIV-1 diagnostic tests in Indonesia. Experimental, analytical study design was used for this research. The Recombinant Pol Immunodominant 2 (ID2) protein in the pQE-80L plasmid of E. coli was expressed under several variables of culture media, inducer concentration, and induction time. The expression culture was visualized using SDS PAGE and documented using ImageQuant Las 4000 machine. Although no statistical analysis was done, Image Lab 6.1 gel analysis software was used to analyze, quantify, and obtain the absolute quantity ratio of protein concentration of each variable. Result: Pol ID2 recombinant protein obtained from HIV-1 subtype CFR01_AE are optimally expressed using Terrific Broth media using 1mM Isopropyl-beta-D-hiogalactopyranoside (IPTG) for 3 hours of induction. Conclusion: It could be concluded that pQE80L-Pol ID2 plasmid previously developed in IHVCB FMUI-RSCM Laboratory can express Pol ID2 recombinant protein from HIV-1 subtype CFR01_AR that is constructed under the same laboratory. The protein expression is optimized in Terrific Broth culture media using 1mM IPTG inducer for 3 hours of induction in 37oC.