Hasil Pencarian  ::  Simpan CSV :: Kembali

Abstrak :
Perkembangan teknologi penyuntingan genom clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR) memberikan kemampuan pada ilmuwan untuk memodifikasi sekuens genom pada sebagian besar sel eukariot. Selain untuk insersi dan delesi gen, penelitian sistem CRISPR-Cas9 juga telah menuju ke arah perkembangan represor transkripsional artifisial CRISPR interference (CRISPRi) dengan sistem dCas9 untuk rekayasa metabolisme melalui penyuntingan metabolic pathways.  dCas9 yang merupakan turunan dari Cas9 saat ini umumnya diproduksi oleh bakteri Streptococcus pyogenes yang merupakan bakteri mesofilik dan menyebabkan Cas9 dan dCas9 yang berasal dari Sterptococcus pyogenes memiliki limitasi terhadap suhu tinggi.  Saat ini eksplorasi terhadap bakteri termofilik sebagai sumber gen Cas9-dCas9 sedang berkembang. Salah satunya adalah bakteri Geobacillus kaustophilus yang tumbuh pada suhu optimal 60˚C dan dapat hidup hingga suhu 74˚C. Dalam penelitian ini, produksi enzim dCas9 dilakukan menggunakan Escherichia coli BL21 sebagai host dan dipurifikasi Immobilized metal affinity chromatography (IMAC). Variasi pemanasan supernatant dilakukan untuk suhu 50˚C, 60˚C, dan 70˚C sebelum purifikasi. Terdapat penurunan konsentrasi protein total dengan semakin tinggi suhu pemanasan, dengan konsentrasi protein total tertinggi pada suhu 50˚C. Purifikasi dilakukan menggunakan 3 buffer elusi dengan konsentrasi imidazole berbeda (250 mM, 350 mM, dan 450 mM). Konsentrasi imidazole 350 mM pada buffer elusi menghasilkan protein dengan konsentrasi total paling tinggi. SDS PAGE silver staining dilakukan untuk melihat berat molekul protein rekombinan yang telah dipurifikasi, dan protein terpurifikasi muncul pada pita ~50 kDa. ......The development of clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR) genome editing technology has given scientists the ability to modify the genome sequences of most eukaryotic cells. In addition to gene insertion and deletion, research on the CRISPR-Cas9 system has also led to the development of artificial transcriptional CRISPR interference repressors (CRISPRi) with the dCas9 system for metabolic engineering through editing of metabolic pathways. dCas9 which is a derivative of Cas9 is currently generally produced by Streptococcus pyogenes which is a mesophilic bacterium and causes Cas9 and dCas9 derived from Streptococcus pyogenes to have limitations against high temperatures. Currently, exploration of thermophilic bacteria as a source of Cas9-dCas9 genes is rising. One of them is the bacterium Geobacillus kaustophilus which grows at an optimal temperature of 60˚C and can live up to 74˚C. In this study dCas9 recombinant production was carried out using Escherichia coli BL21 as the host and Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC) purification. Variation of supernatant heating was carried out for temperatures of 50˚C, 60 ˚C, and 70 ˚C before purification. There was a decrease in total protein concentration with higher heating temperature, with the highest total protein concentration at 50 ˚C. Purification was carried out using 3 elution buffers with varying imidazole concentrations (250 mM, 350 mM, and 450 mM). The imidazole concentration of 350 mM in the elution buffer produced fractions with the highest total protein concentration. SDS PAGE silver staining was performed to determine the molecular weight the purified fraction, and bands appeared in the ~50 kDa band.

Abstrak :
Kemajuan dalam teknologi penyuntingan genom menggunakan Clustered Regularly  Interspaced Short Palindromic Repeat (CRISPR) memberi kemampuan kepada para  ilmuwan untuk mengubah sekuens genom pada sebagian besar sel eukariot. Saat ini,  penelitian terkait sistem CRISPR-Cas9 juga berkembang menuju pengembangan sistem represor transkripsional CRISPR interference (CRISPRi) dengan menggunakan sistem dCas9 yang bertujuan untuk mengarahkan rekayasa metabolisme melalui  penyuntingan jalur metabolisme. Saat ini belum banyak penelitian yang memproduksi enzim dCas9 menggunakan metode ekstraseluler yang lebih efisien dan ekonomis. Pada penelitian ini, produksi enzim dCas9 dilakukan secara ekstraseluler dengan menggunakan bakteri Geobacilus kaustophilus dan Escherichia coli BL21 sebagai host dan dipurifikasi dengan menggunakan Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC) dengan penggunaan variasi konsentrasi IPTG, yakni 0,05 mM dan 0,5 mM, dan suhu pemanasan, yakni pada suhu 50oC dan 70EC. Pada suhu pemanasan 50°C dan konsentrasi IPTG 0,5 mM, konsentrasi protein yang didapatkan adalah 1.971 o‡g/mL, sedangkan ketika suhu pemanasan dinaikkan menjadi 70°C konsentrasinya menjadi sebesar 487 o‡g/mL. Pada suhu 50oC, konsentrasi IPTG yang diturunkan menjadi 0,05 mM menghasilkan protein dengan konsentrasi sebesar 281 o‡g/mL. Identifikasi protein dengan uji SDS-PAGE menunjukkan ukuran protein hasil purifikasi sebesar 64,76 kDa. ......Advancements in genome editing technology using Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat (CRISPR) provide scientists with the ability to modify genome sequences in most eukaryotic cells. Currently, research related to the CRISPR-Cas9 system is also evolving towards the development of the CRISPR interference (CRISPRi) transcriptional repressor system using the dCas9 system, aimed at directing metabolic engineering through pathway editing. At present, there is limited research on producing dCas9 enzymes using a more efficient and economical extracellular method. In this study, dCas9 enzyme production was carried out extracellularly using Geobacillus kaustophilus and Escherichia coli BL21 as hosts and purified using Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC) with variations in IPTG concentrations, namely 0,05 mM and 0,5 mM, and heating temperatures, namely at 50°C and 70°C. At a heating temperature of 50°C and an IPTG concentration of 0,5 mM, the protein concentration obtained was 1,971 μg/mL. When the heating temperature was increased to 70°C, the concentration became 487¼g/mL. At 50°C, lowering the IPTG concentration to 0,05 mM resulted in a protein concentration of 281¼g/mL. Protein identification using SDS-PAGE showed the size of the purified protein to be 64,76 kDa.