Hasil Pencarian  ::  Simpan CSV :: Kembali

Abstrak :
Latar Belakang: APOBEC3G, apolipoprotein B mRNA-editing enzyme, catalytic polypeplidelike JG, merupakan protein manusia yang dapat mengganggu replikasi HIV dengan memasukkan dirinya ke dalam partikel virus dan merusak susunan materi genetik virus. Beberapa studi terbaru menunjukkan bahwa APOBEC3G manusia mengatur infektivitas HIV-1 dengan mendeaminasi dC menjadi dU pada rantai minus DNA yang baru dibentuk, menyebabkan hipermutasi G menjadi A dari rantai plus DNA viral. Induksi hlpermutasi oleh APOBEC3G dapat menyebabkan pembentukan stop kodon pada ORF protein virus dan memicu degradasi DNA virus oleh glikosilase DNA urnsil yang selanjutuya dapat menghambat replikasi HIV. Protein ini layak untuk diteliti lebih lanjut dalam rangka pengembangan anti retrovirus yang berbasis pacta mekanisme penghambatan replikasi HIV-1 melalui jalur APOBEC3G. Sebagai langkab awal, diperlukan sistem ekspresi gen APOBEC3G yang akan diperoleh melalui sintesis dan kloning gen APOBEC3G ke dalam vektor ekspresi DNA rekombinan. Metode: Untuk mendapatkan mRNA APOBEC3G yang akan digunakan sebagai pola cetak dalam sintesis eDNA APOBEC3G, dilalkukan ekstraksi RNA dari sel CEM-GFP menggunakan Rneasy Mini Kit. Agar DNA APOBEC3G lengkap dapat diperoleh dengan lebih mudah, sintesis DNA serat ganda APOBEC3G menggunakan reaksi RT-PCR dua tahap, dibagi atas tiga daerah pada gen APOBEC3G dengan susunan nukleotida yang bertumpang tindih (overlapping) pada bagian ujung segmen DNA yang akan berfungsi sebagai penyambung fragmen-fragmen tersebut menjadi DNA APOBEC3G utub. Hasil: Hasil eksperimen menunjukloan ketiga fragmen APOBEC3G yang masing-masing berukuran 452 pb, 458 pb,dan 433 pb berhasil dibentuk lewat reaksi PCR dengan menggunakan enzim Pfx dan diklona ke dalam vektor plasmid. Kesimpulan: DNA APOBEC3G yang dibagi menjadi 3 fragmen telah berhasil didapat dan terklona ke dalam pBluescript KS (-). Pekerjaan lanjutan akan dilakukan untuk verifikasi sekuen fragmen-fragmen terklona dan menyambung ketiga fragrnen tersebut menjadi DNA APOBEC3G yang utub yang kemudian akan diklona ke dalam vektor ekspresi.

---

Background: APOBEC3G, apolipoprotein B rnRNA-cditing enzyme, catalytic polypeptide-like JG,is a human protein that interferes with the replication of HIV by incorporating itself into virus particles and damaging the genetic material of the virus. Several recent studies revealed that human APOBEC3G regulates HIVI infectivity by dearninating dC to dU in the newly synthesized minus strand DNA, resulting in G to A hypermutation of the viral plus strand DNA. Hypermutation induced by APOBEC3G may result in the introduction of stop codons in viral protein open reading frame and degradation of viral DNA by ura<:il-DNA glyoosylase, therefore blocking HlV replication. This protein is therefore suitable for further investigation for the development of ARV (AntiRetroviral) that is based on mechanism of blocking HIV-1 replication inhibition by APOBEC3G through the pathway. In order to obtain the APOBEC3G protein, an expression system of the APOBEC3G gene is required, which will be obtained by synthesis and cloning of the APOBEC3G gene into an expression vector. Method: To obtain the APOBEC3G mRNA that will be used as template for synthesis of APOBEC3G eDNA by RT-PCR using Omniscript enzyme, we performed RNA extraction from CEM-GFP cell line using the Rneasy Mini !Gt. In order to facilitate the synthesis of a complete APOBEC3G DNA, the APOBEC3G DNA double stranded was divided into three regions with overlapping nucleotide sequences at the DNA ends that function in the joining of the fragments into a full length APOBEC3G DNA. Results: The result of the experiments showed that the three fragments of APOBEC3G gene of 452 bp, 458 bp, and 433 bp, were successfully produced by PCR reaction using Pfx enzyme, and cloned into plasmid vector. Conclusions: APOBEC3G DNA that was divided into three fragments has been obtained and cloned illlo Bluescript KS (-) vector. Further study, will be performed to verifY the cloned fragments, and to fuse the fragments into a complete APOBEC3G DNA that will be cloned into an expression vector.

Abstrak :
Replikasi virus HIV-1 pada tubuh pasien dapat ditekan dengan penggunaan antiretroviral. Namun virus HIV-1 mudah mengalami mutasi yang menyebabkan penurunan sensitifitas satu atau lebih antiretroviral dalam menahan laju replikasi virus. Oleh karena itu diperlukan kelas antiretroviral baru yang tidak rentan terhadap mutasi virus, misalnya dengan menginhibisi interaksi protein antiviral alami manusia seperti APOBEC3G dengan protein-protein virus. Dalam penelitian ini dilakukan studi pendahuluan untuk membuat sistem penapisan antiretroviral berbasis interaksi protein APOBEC3G dengan protein Vif HIV-1 secara in vitro. Penelitian diawali dengan mendesain gen APOBEC3G yang dapat diekspresikan dengan baik di sistem prokariota. Gen APOBEC3Gopt telah dapat diklona ke plasmid vektor pQE80L dan diekspresikan di E.coli BL21 pada suhu 37 oC dengan induksi IPTG 1 mM, namun berat molekul protein APOBEC3G tidak sesuai dengan teoritis yang diperkirakan diakibatkan oleh pemotongan protein oleh protease. Protein Vif diekspresikan dalam E.coli BL21 Codon Plus pada suhu 37 oC dengan induksi IPTG 1 mM. Purifikasi protein Vif dan APOBEC3G menggunakan IMAC Immobilized Metal Affinity Chromatography matriks NiNTA dilakukan dengan keadaan denaturasi dan telah dilakukan refolding dengan cara dialisis. Protein Vif hasil dialisis dapat berinteraksi dengan protein-protein dalam sel secara in vitro. Protein Vif dan APOBEC3G disuntikkan ke kelinci dan diperoleh antibodi IgG terhadap Vif dan APOBEC3G pada minggu ketiga paska penyuntikan. Optimasi keadaan ELISA yang dilakukan untuk protein Vif menunjukkan konsentrasi protein Vif 25 g/mL, pengenceran serum 1/1.000 dan skim milk sebagai protein blocker, memberikan hasil terbaik. Optimasi keadaan ELISA yang dilakukan untuk protein APOBEC3G menunjukkan konsentrasi protein APOBEC3G 25 g/mL, pengenceran serum 1/1.000 dan skim milk sebagai protein blocker, memberikan hasil terbaik.

---

HIV 1 replication in vivo can be reduced by using antiretroviral. However, HIV 1 virus is easily mutated that leads to reduction of antiviral sensitifity. Therefore, a new class of antiretroviral which is not susceptible toward viral mutation is highly required. One of the options is to inhibit natural antiviral protein such as APOBEC3G to interact with viral protein Vif HIV 1. This research is a preliminary study to establish a new method to screen antiretroviral candidates which inhibit interaction between APOBEC3G and Vif HIV 1. The research begins with APOBEC3G gene optimization for prokaryotic system. The gene successfully cloned to pQE80L vector and highly expressed in E.coli BL21 strain with 1mM IPTG induction in 37 oC. However, the molecular weight of APOBEC3G protein is not suitable with theoretical molecular weight. Vif protein is expressed in E.coli BL21 Codon Plus strain with 1 mM IPTG induction in 37 oC. Vif and APOBEC3G is purified using IMAC Immobilized Metal Affinity Chromatography method with NiNTA matrix in denaturing condition and successfully refolded using dialysis method. Purified Vif protein can interact with other cellular protein in vitro. Rabbits were immunized with Vif and APOBEC3G protein and high titer of IgG anti Vif and anti APOBEC3G were obtained in 3 weeks after immunization. ELISA technique conducted for Vif protein shows that 25 g mL Vif protein, 1 1.000 serum dilution, and skim milk as the protein blocker give the optimal condition. As for the APOBEC3G protein, the optimal condition obtained is also 25 g mL APOBEC3G protein, 1 1.000 serum dilution, and skim milk as the protein blocker.

Abstrak :
Protein APOBEC3G merupakan salah satu protein intrinsik sel imun manusia yang memiliki kemampuan antiretroviral terhadap infeksi HIV-1. Protein Vif HIV-1 dapat merangsang degradasi APOBEC3G sehingga penghambatan interaksi antara kedua protein tersebut melalui inhibitor berpotensi digunakan dalam pengembangan antiretroviral baru. Pengembangan antiretroviral baru melalui interaksi antara protein APOBEC3G dengan protein Vif HIV-1 memerlukan protein rekombinan APOBEC3G. Protein APOBEC3G diperoleh dengan cara melakukan ekspresi gen APOBEC3G yang telah dikloning ke dalam vektor ekspresi pQE-80L. Ekspresi protein APOBEC3G dilakukan dalam sistem ekspresi prokariota yaitu bakteri Escherichia coli BL21-CodonPlus (DE3). Ekspresi protein dilakukan pada tiga kondisi optimasi yaitu suhu, konsentrasi IPTG dan waktu inkubasi setelah induksi. Berdasarkan penelitian, APOBEC3G berukuran 43,08 kDa dapat diekspresikan paling optimal pada induksi IPTG 0,5 mM pada suhu 37oC waktu inkubasi 4 jam setelah induksi. ...... APOBEC3G is one of intrinsic protein in human immune system. It has an antiretroviral ability against HIV-1 infection. However, HIV-1 has Vif protein which stimulate degradation of APOBEC3G. Therefore, inhibition of interaction between both proteins by an inhibitor is potentially used in development of new antiretroviral agents. The development of new antiretroviral using interaction of APOBEC3G and Vif HIV-1 needs recombinant protein of APOBEC3G. This APOBEC3G recombinant protein can be produced by expression of APOBEC3G gene cloned into pQE-80L expression vector in prokaryotic system of Escherichia coli BL21-CodonPlus (DE3). Protein expression conducted in three optimization condition: themperature, IPTG concentration, and incubation time after induction. Based on this research, APOBEC3G which has 43,08 kDa molecular weight is expressed optimally in 0,5 mM IPTG induction at 37oC and incubation time 4 hours after induction.