Hasil Pencarian  ::  Simpan CSV :: Kembali

"DNA polimerase merupakan enzim yang mampu menyintesis DNA komplemen dari sebuah untaian DNA induk. Enzim ini diproduksi oleh seluruh mahluk hidup, namun jenis yang tahan panas lebih lazim digunakan karena cenderung tidak mengalami denaturasi dalam proses polymerase chain reaction (PCR). Enzim ini dapat diperoleh dengan mengisolasi langsung dari bakteri asal maupun membuat gen rekombinan dan mentransformasikannya ke dalam inang yang lebih mudah dikultur. Tujuan utama dari penelitian ini adalah memperoleh enzim ini dengan metode rekombinan dengan memanfaatkan bakteri inang Escherichia coli. Produksi DNA polimerase rekombinan didasarkan pada bakteri termofilik Geobacillus thermoleovorans dari permandian air panas Batu Kuwung, Serang, Banten yang telah sebelumnya diisolasi dan melalui proses whole genome sequence. DNA polimerase yang dibuat gen rekombinan adalah DNA pol I yang diketahui memiliki fidelitas rendah. Gen DNA polimerase dari Geobacillus thermoleovorans dikloning ke dalam plasmid pET23d baik gen utuh (2637 bp) maupun parsial (1737 bp). Gen DNA pol I menjadi target untuk proses polymerase chain reaction (PCR) untuk diperbanyak sebelum di potong dengan menggunakan enzim restriksi NcoI dan BamHI. Gen yang telah dipotong lalu di masukkan ke dalam plasmid pET23d yang telah dipotong dengan enzim restriksi yang sama. Plasmid yang telah didapatkan di transformasikan ke dalam Escherichia coli BL21 untuk pengujian ekspresi proteinnya. Hasil analisis dengan menggunakan PCR menunjukkan bahwa gen DNA pol I baik utuh maupun parsial berhasil dikloning ke dalam plasmid pET23d. Keberhasilan dari proses kloning yang dilakukan juga dibuktikan dari hasil uji ekspresi secara intraseluler protein rekombinan DNA pol I pada E. coli. Hal ini mengindikasikan bahwa gen DNA pol I dari Geobacillus thermoleovorans pemandian air panas Batu Kuwung, Serang, Banten berhasil di kloning dan diekspresikan di E. coli.

---

DNA polymerase is an enzyme that synthesizes complement DNA according to single strand template DNA. This enzyme is produced in all living organism, but the thermostabile ones are more favoured because less prone to denaturation in polymerase chain reaction (PCR). The enzyme can be acquired by isolating the enzyme from the native bacteria or manufacturing recombinant gene then insert it into a host that is easier to be cultivated. The main purpose of this study is to acquire the enzyme by manufacturing recombinant gene and utilizing Escherichia coli as the host. The recombinant DNA polymerase manufacturing is based on thermophilic bacteria Geobacillus thermoleovorans from Batu Kuwung Hotspring, Serang, Banten which has been previously isolated and went through whole genome sequence process. DNA polymerase that will be produced is DNA pol I that is known has low fidelity. There are two genes that are cloned into pET23d vector, such as full gene (2637 bp) and partial gene (1737 bp). DNA pol I gene is the subject to polymerase chain reaction (PCR) to amplify before being cut with restriction enzymes of NcoI and BamHI. The cut genes then are inserted into pET23d that is also cut with the same enzymes. The acquired plasmids then is transformed into Escherichia coli BL21 for protein expression assay. PCR analysis shows that the DNA pol I both full and partial are successfully cloned into pET23d. The successes are also supported from intercellular DNA pol I protein test expression assay in E. coli. This foundings indicate that the DNA pol I from Geobacillus thermoleovorans isolated from Batu Kuwung hot spring, Serang, Banten, is successfully cloned and expressed by E. coli."

"DNA polimerase merupakan sebuah enzim yang memiliki aplikasi luas dalam dunia bioteknologi. Peran DNA polimerase dalam sintesis DNA membuat DNA polimerase sebuah reagen yang sering digunakan pada berbagai metode amplifikasi DNA. Proses sintesis DNA pada metode-metode tersebut menggunakan suhu tinggi, sehingga dibutuhkan DNA polimerase yang tidak terdenaturasi pada suhu tinggi atau dengan kata lain termostabil. Salah satu sumber DNA polimerase termostabil adalah bakteri termofilik Geobacillus thermoleovorans Strain SGAir0734 (GBK Pol) yang diisolasi dari mata air panas Batu Kuwung, Banten, Indonesia. Pada penelitian sebelumnya, telah diuji coba produksi dari GBK Pol dengan suhu purifikasi pada rentang 60 – 80℃ dimana diduga terjadi denaturasi dari enzim. Maka dari itu, pada penelitian ini dilakukan purifikasi GBK Pol sekuens utuh dan parsial dengan metode immobilized metal affinity chromatography (IMAC) dengan rentang suhu 40 – 60℃ dan uji aktivitas amplifikasi DNA dengan metode loop mediated isothermal amplification (LAMP) dengan rentang suhu 25 – 60℃. Hasil uji Lowry menunjukkan bahwa pemanasan 60℃ menghasilkan GBK pol dengan konsentrasi tertinggi, yaitu sekitar 134 µg/ml untuk plasmid sekuens utuh. GBK pol hasil purifikasi kemudian diuji aktivitasnya dengan LAMP, dimana reaksi pada suhu 40℃ selama 2 jam menghasilkan pita yang jelas pada elektroforesis dan menghasilkan konsentrasi DNA tertinggi. GBK pol dari hasil purifikasi dengan pemanasan 60℃ menghasilkan konsentrasi DNA tertinggi pada LAMP suhu 40℃ baik untuk sekuens parsial dan utuh.

---

DNA polymerase is an enzyme that has a wide application in the world of biotechnology. DNA Polymerase’s role in synthesizing DNA makes DNA polymerase a favorable reagent in various DNA amplification methods. The synthesis process in these methods is done in high temperatures, thus a DNA polymerase that won’t experience denaturation in high temperatures, or in other words thermostable, is needed. One source of thermostable DNA polymerase is the thermophilic bacteria Geobacillus thermoleovorans Strain SGAir0734 (dubbed GBK Pol) that has been isolated from Batu Kuwung hot springs, Banten, Indonesia. In the previous study, a production trial of GBK pol has been carried out with purification temperatures that range between 60 – 80℃, where denaturation of the enzyme is suspected to have happened. As such, in this study, lower temperatures of 40 – 60℃ are employed in the purification of GBK Pol with immobilized metal affinity chromatography (IMAC) as well as in the activity study with loop mediated isothermal amplification (LAMP) with reaction temperatures of 25 – 60℃. The Lowry assay results show that the highest GBK pol concentration is achieved with 60℃ heat treatment, with a concentration of around 134 µg/ml for full sequence plasmid. Purified GBK pol are then tested with LAMP, where isothermal amplification at 40℃ for 2 hours resulted in the clearest bands during gel electrophoresis as well as highest concentrations of DNA. The highest concentration of DNA is achieved from GBK pol with 60℃ heat treatment, suggesting that 60℃ is the optimal temperature for purification."

"DNA polimerase memiliki peran yang penting untuk memperbanyak DNA target dalam proses Polymerase Chain Reaction (PCR). Proses PCR dilakukan dalam suhu tinggi, sehingga DNA polimerase termostabil yang tidak terdenaturasi dalam suhu tinggi lebih disukai. Pada penelitian sebelumnya telah dilakukan isolasi dan kloning sekuens DNA polimerase termostabil dari Geobacillus thermoleovorans strain SGAir0734 dari pemandian air panas Batu Kuwung, Serang, Banten. Sekuens utuh DNA polimerase tersebut (2637 bp) digunakan sebagai dasar pembuatan sekuens parsialnya (1737 bp) dengan menghilangkan bagian eksonuklease. DNA polimerase sekuens parsial memiliki keunggulan dapat memproses PCR dengan lebih cepat. Pada penelitian ini, akan dilakukan optimisasi produksi sekuens parsial dari DNA polimerase termostabil rekombinan dari Geobacillus thermoleovoran strain SGAir0734 (GBK Pol Sekuens parsial). Gen GBK Pol Sekuens parsial dimasukkan ke dalam plasmid pET-15b. Plasmid tersebut ditransformasikan ke dalam Escherichia coli BL21. Escherichia coli dikultur dan protein diekspresikan dengan IPTG sebagai zat penginduksi. GBK Pol sekuens parsial ini kemudian dipanaskan dan lanjut ke purifikasi dengan metode Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC) menggunakan kolom His-Trap. GBK Pol sekuens parsial yang sudah berhasil dipurifikasi diuji dengan uji SDS-PAGE dan uji Lowry. Uji SDS PAGE menunjukkan bahwa ukuran protein yang didapatkan berkisar pada 58,1 kDa. Pada penelitian ini didapatkan konsentrasi GBK Pol sekuens parsial paling banyak dipurifikasi dari sampel hasil pemanasan dengan variasi inoculum 20 mL dan suhu pemanasan 60℃, yaitu sekitar 343,931 µg/ml.

---

DNA polymerase has an important role to amplify target DNA in the Polymerase Chain Reaction (PCR) process. PCR is carried out at a high temperature, so thermostable DNA polymerase which is undenatured at high temperatures is preferred. In previous study, thermostable DNA polymerase from Geobacillus thermoleovorans strain SGAir0734 from Batu Kuwung hot springs, Serang, Banten has been isolated and cloned. The full sequence of DNA polymerase (2637 bp) was used as the basis for making the partial sequence (1737 bp) by removing the exonuclease region. The advantage of partial sequence DNA polymerase is that it can process PCR more quickly. In this study, optimization of the production and purification of partial sequences of thermostable recombinant DNA polymerase from Geobacillus thermoleovorans strain SGAir0734 (GBK Pol Partial sequence) will be carried out. GBK Pol Partial sequence gene was inserted into plasmid pET-15b. The plasmid was transformed into Escherichia coli BL-12. Escherichia coli are cultured, and proteins are expressed by adding IPTG as an inducing agent. The GBK Pol partial sequence will be heated and then proceed to purification by Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC) method using His-Trap column. GBK Pol Partial sequence that has been successfully purified is tested using SDS-PAGE and Lowry test. In this study, the SDS PAGE test showed that the protein size was in the range of 58,1 kDa. The concentration of GBK Pol partial sequence was found to be the most purified from the heating sample with variation of 20 mL inoculum and heating temperature of 60℃, which was around 343,931 µg/ml."

"Pada pandemi COVID-19 diagnostik berbasis amplifikasi DNA dijadikan sebagai gold standard. Hal tersebut menyebabkan meningkatnya permintaan terhadap instrumentasi dan reagen amplifikasi DNA kedepannya. Indonesia, tidak memproduksi instrumentasi dan reagent secara lokal, sehingga bergantung pada impor. Hal tersebut mengkahwatirkan secara logistik dan ketahan industri domestik kedepannya. Dibutuhkan upaya mandri memproduksi instrumentasi dan reagent domestik. Sehingga dikembangkan prototipe thermocycler berbasis bahasa Phyton dan ditemukannya DNA pol lokal dari Geobacillus thermoleovorans SgAir0734 dari Batu Kuwung Banten (GBK pol). Prototipe thermocycler sebelumnya sudah dilakukan simulasi panas namun belum dilaksanakan uji coba untuk melakukan diagnostik berbasis amplifikasi DNA. GBK pol memiliki dua bentuk full (878 asam amino) dan parsial (578 AA), full memiliki bagian proofreading, baru ditemukan sekuens dan dikloning namun belum dilaksanakan uji coba aktivitasnya. Sehingga pada skripsi ini akan dicoba metode diagnostik berbasi polymerase chain reaction (PCR) dan loop-mediated isothermal amplification (LAMP) menggunakan prototipe thermocycler dan GBK pol. PCR merupakn metopde paling umum diagnostik berbasis amplifikasi DNA. Sedangkan LAMP memiliki keunggulan waktu lebih singkat dan beroperasi pada suhu lebih rendah. Enzim dari genus bacillus/geobacillus cenderung memiliki strand displacement activity (SDA) tinggi dan digunakan pada LAMP. Dikarenakan prototipe thermocycler dirancang sesederhana dan semurah mungkin untuk memudahkan manufaktur dan akses ke seluruh lapisan masyarakat. Sistem kendali panas prototipe tidak sebaik thermocyler komersil, terjadi resonansi suhu yang fluktuatif dari set-point. Sehingga prototipe belum bisa digunakan pada proses PCR, tidak ditemukan pita DNA di rentang 250-500 bp pada gel elektroforesis. Namun prototipe berhasil pada proses LAMP, dengan menunjukan pita DNA bergradien <100 bp pada gel elektroforesis. Prototipe juga dapat melakukan proses LAMP dibawah suhu dan waktu protokol, 62◦C dan 40 menit dibandingkan 66◦C dan 60 menit pada protokol. Dari empat sampel GBK pol : parsial puncak 1, parsial puncak 2, full peak , dan full peak 2 tidak dapat berekasi secara PCR baik dengan konsentrasi 200 dan 400ng. Sedangkan pada proses LAMP pada suhu 62 dan 66◦C selama 1 jam semua sampel tidak bereaksi. Sedangkan, pada suhu 58◦C dan 2 jam ditemukan aktivitas pada sampel GBK pol full puncak 2.

---

COVID-19 pandemic causes DNA amplification-based diagnostic as a gold standard. Thus, increasing the demand for instrumentation and amplification reagents locally, hence increasing import. It is a worrying state in terms of logistics and the future domestic market. An effort to produce domestic instrumentations and amplification reagents is a must. Previously a thermocycler prototype using Phyton as its software is constructed and the discovery of local DNA pol from Geobacillus thermoleovorans SgAir0734 from Batu Kuwung Banten (GBK pol). Thermocycler prototype heat profile has previously been tested but never put on a real test for DNA amplification diagnostic. Full (878 amino acid) and partial (578 amino acid) GBK pol, with full has proofreading region, is successfully sequenced and cloned, but its activity has not been tested. Thus in this thesis, both thermocycler prototype and GBK pol both tested for polymerase chain reaction (PCR) and loop-mediated isothermal amplification (LAMP) diagnostic. PCR is the most and more common method than LAMP. LAMP has a quicker reaction time and require lower temperature. DNA pol from the genus geobacillus/bacillus has high strand displacement activity (SDA) which are commonly used for LAMP. Since the prototype thermocycler is designed to be as simple and inexpensive as possible for ease of manufacture and accessibility for every layer of society. Hence, its thermal control is not as good as a commercial thermocycler, with huge temperature fluctuation resonance from its set-point. That causes prototype capability of performing PCR, no DNA band at 250-500 bp range in gel electrophoresis. However, the prototype is capable of performing LAMP, existing <100 bp DNA gradient band in gel electrophoresis. The prototype also capable of perform LAMP below its protocol temperature and time, 62◦C and 40 minutes compared to the protocol of 66◦C and 60 minutes. Four samples of GBK pol : partial peak 1, partial peak 2, full peak 1, and full peak 2 there are no PCR reactions with 200 and 400 ng. The same with the LAMP process for 1 hour at 62 and 66◦C. However GBK pol full peak 2 reacted in 58◦C for 2 hours"

"Indonesia memiliki ketergantungan terhadap impor kit untuk Polymerase Chain Reaction (PCR). Salah satu komponen krusial dalam PCR adalah DNA polimerase termostabil. Hal ini tidak sebanding dengan Indonesia yang terletak pada Ring of Fire, dimana Indonesia memiliki potensi ekosistem geothermal yang besar sebagai habitat bakteri termofilik penghasil DNA polimerase termostabil. Gen DNA pol I lokal dari Geobacillus thermoleovorans Batu Kuwung, Banten, telah berhasil dikloning pada plasmid pET-15b dan ditransformasikan pada Escherichia coli BL21. Meskipun GBK pol memiliki peran yang sangat penting dalam amplifikasi isothermal yang menjadikannya dapat diaplikasikan dalam PCR, untuk dapat memproduksi GBK pol secara komersil masih dinilai kurang layak secara ekonomi. Penelitian yang telah dilakukan untuk GBK pol masih memiliki keterbatasan dalam optimalisasi dan produksi scale-up. Oleh karena itu, pada penelitian ini dilakukan optimasi kondisi ekspresi seperti: kecepatan agitasi, waktu inkubasi setelah induksi, volume kerja dan peningkatan skala produksi pada 7,5 L bioreaktor untuk meningkatkan efisiensi, produksi dan ekspresi. Pada penelitian ini didapatkan kondisi optimum pada kecepatan agitasi 200 rpm, waktu inkubasi setelah induksi 4 jam dan 20% volume kerja. Selain itu, pada penelitian ini berhasil dilakukan produksi GBK pol pada 7,5 L bioreaktor dan menghasilkan konsentrasi protein tertinggi sebesar 0,042 µg/µL dengan waktu optimum untuk inkubasi setelah induksi selama 3 jam.

---

Indonesia relies on imported kits for Polymerase Chain Reaction (PCR). In fact, one of the crucial components in PCR is thermostable DNA polymerase. This is not comparable to Indonesia’s potential which is located on the Ring of Fire. Consequently, Indonesia holds the potential for a large geothermal ecosystem which serves as a habitat for thermophilic bacteria capable of producing thermostable DNA polymerase. The local DNA pol I gene from Geobacillus thermoleovorans Batu Kuwung, Banten, has been successfully cloned into the plasmid pET-15b and transformed into Escherichia coli K pol in isothermal amplification, making it applicable for PCR, the commercial production of GBK pol is still considered economically unfeasible. The research conducted for GBK pol still has limitations in optimization and scale-up production. Therefore, in this study optimization of expression conditions was carried out, including the speed of agitation, post-induction incubation time, working volume and scale-up production at 7,5 L bioreactor to increase efficiency, production, and expression. In this study, the optimum conditions were obtained at an agitation speed of 200 rpm, a post-induction incubation time of 4 hours and 20% working volume. Furthermore, the production of GBK pol was successfully carried out in a 7.5 L bioreactor, resulting in the highest protein concentration of 0.042 µg/µL with the optimum post-induction incubation time for 3 hours."