Hasil Pencarian  ::  Simpan CSV :: Kembali

Abstrak :
Infeksi dengue DENV adalah penyakit yang diperantarai nyamuk yang manifestasinya dapat mengarah pada dengue hemorrhagic fever DHF dan/atau dengue shock syndrome DSS yang dapat mengakibatkan kematian. Di Indonesia, DHF sudah endemis dan menjadi penyakit yang terjadi sepanjang tahun. Protein non struktural-1 NS1 dari DENV diketahui merupakan biomarker dalam diagnosis dengue karena protein ini bersirkulasi dalam darah selama fase akut penyakit. Penelitian ini bertujuan untuk mengembangkan antibodi monoklonal mAb untuk mendeteksi antigen NS1 dari DENV serotipe 3 DENV3. Sel hibridoma penghasil mAb diperoleh dengan memfusikan sel B dari mencit yang diimunisasi dengan antigen NS1 yang diekspresikan pada sel CHO-K1 dengan sel PAI myeloma. Seleksi hibridoma dengan ELISA indirect diperoleh 16 klona yang berpotensi menghasilkan antibodi anti-NS1. Tujuh klona terbaik dipilih untuk dikarakterisasi dengan metode IFA terhadap antigen rekombinan NS1 dan hasilnya 6 klona positif menunjukkan reaksi sinyal fluoresens. Klona mAb 4-2D, 4-4F, dan 2-7A diuji terhadap protein NS1 native dari DENV1, DENV2, DENV3, dan DENV4, dan ketiga mAb tersebut mampu mengenali secara spesifik protein NS1 dan tidak bereaksi terhadap protein virus yang lain. Terdapat reaktivitas silang dengan 3 serotipe lainnya yang mengindikasikan bahwa mAb yang diujikan mengenali epitop lestari antigen NS1. Analisis prediksi epitop NS1 juga dilakukan secara in silico terhadap beberapa strain DENV lainnya. Namun, studi lebih lanjut mengenai pemetaan epitop dan afinitas pengikatan antigen-antibodi perlu dilakukan untuk menentukan mAb yang paling potensial sebagai bahan baku kit diagnostik. ...... Dengue DENV is a mosquito borne infection disease which its manifestation can be lead to a lethal dengue hemorrhagic fever DHF and or dengue shock syndrome DSS . In Indonesia, DHF has been endemic and the disease occurs throughout the year. Non structural 1 NS1 protein of DENV is known to be a biomarker in dengue diagnosis since the protein is abundantly circulating in the blood during acute phase of the disease. The aim of this study to develop monoclonal antibodies mAbs derived from DENV3 to detect NS1. Hybridoma mAb producing cells were obtained by fusing B cells from an immunized mice with NS1 antigen expressed on CHO K1 cells, with PAI myeloma cells. Hybridoma selection with indirect ELISA showed 16 clones that could be potentially produce anti NS1 antibodies. Seven up to sixteen clones were selected to be characterized by IFA against recombinant NS1 antigen and the result showed 6 clones produce fluorescence signals. Clones mAb 4 2D, 4 4F, and 2 7A were tested against native NS1 proteins from DENV1, DENV2, DENV3, and DENV4, and these mAbs were able to recognize specifically NS1 protein and did not react against other viral proteins. There is a cross reactivity within 3 other serotypes which initially indicate that mAbs recognizes the conserved epitopes determinant of the NS1 antigen. Epitopes prediction analysis was also performed in silico against several others DENV strains. However, further studies of epitope mapping and antigen antibody binding affinity are necessary to determine the most potential mAbs for diagnostic tools.

Abstrak :
Infeksi dengue merupakan salah satu masalah utama kesehatan di dunia, termasuk di Indonesia. Angka kejadian demam berdarah dengue di Indonesia terus meningkat sejak tahun 1968 sampai tahun 2013. Akan tetapi, laju kematian atau case fatality ratio akibat demam berdarah dengue mengalami penurunan karena adanya deteksi infeksi dengue secara dini menggunakan antibodi monoklonal dan protein biomarka non-struktural 1 (NS1). Pengembangan antibodi monoklonal dengan teknologi hibridoma sebagai bahan baku kit diagnostik dengue terkendala masalah biaya produksi yang mahal dan waktu produksi yang relatif lama, sehingga dibutuhkan alternatif lain seperti pengembangan antibodi rekombinan. Penelitian ini dilakukan untuk memperbanyak gen rantai berat (heavy chain) dan rantai ringan (light chain) penyusun fragment antigen binding (Fab) rekombinan dari sel hibridoma lokal 71E2 yang telah diinduksi dengan virus dengue sehingga diharapkan mampu mensekreksikan antibodi anti-NS1. Gen heavy chain dan light chain diamplifikasi dengan menggunakan teknik polymerase chain reaction (PCR), kemudian divisualisasi dengan menggunakan elektroforesis gel agarosa. Produk PCR gen heavy chain menghasilkan pita berukuran 600 bp, sedangkan produk PCR gen light chain menghasilkan pita berukuran 350 bp. Plasmid rekombinan yang terdiri atas gen heavy chain/light chain dan vektor pTA2 ditransformasi ke dalam Escherichia coli TOP10 dengan menggunakan metode heat shock. Teknik PCR, digesti, dan sekuensing digunakan untuk mengkonfirmasi keberadaan gen target pada plasmid rekombinan. Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa gen heavy chain dan light chain yang berasal dari sel hibridoma 71E2 berhasil dikloning pada vektor pTA2 di dalam E. coli TOP10. Akan tetapi, diperlukan studi lebih lanjut untuk mengevaluasi kemampuan ekspresi Fab rekombinan yang tersusun atas gen heavy chain dan light chain hasil kloning sebagai material penting dalam pengembangan kit diagnostik dengue.

---

Dengue infection is one of major health problem which spread worldwide including in Indonesia. The dengue hemorrhagic fever (DHF) incidence in Indonesia increased rapidly from 1968 until 2013. However, the case fatality ratio decreased during the same period due to early detection of dengue infection by using monoclonal antibody and non-structural 1 (NS1) protein biomarker. The development of monoclonal antibody with hybridoma technology as raw material for dengue diagnostic kit was constrained by the expensive production costs and relatively long production time so that other alternatives are needed such as the development of recombinant antibody. This early study was conducted to clone heavy chain and light chain gene of recombinant fragment antigen binding (Fab) using local hybridoma cell 71E2 secreting monoclonal antibody anti-NS1 which was induced by dengue virus. The heavy chain and light chain gene of Fab were amplified by polymerase chain reaction (PCR) and then visualized by agarose gel electrophoresis. Heavy chain PCR product produces a band at 600 bp, while light chain PCR product produces a band at 350 bp. The recombinant plasmid that consists of the gene and pTA2 vector were transformed to Escherichia coli TOP10 using heat shock method. Polymerase chain reaction, digestion, and sequencing method then used to confirm the gene insertion in the recombinant plasmid. The results showed that the heavy chain and light chain gene from hybridoma cell 71E2 were successfully cloned on the pTA2 vector in E. coli TOP10. However, further study should be conducted to evaluate the expression of the recombinant Fab from heavy chain and light chain gene as a valuable material in the development of dengue diagnostic kit.