Hasil Pencarian  ::  Simpan CSV :: Kembali

Abstrak :
Latar belakang: Vaksin HIV-1 berbasis protein Gag diharapkan dapat menstimulus respon imun sel T CD8+ (sitotoksik). Protein Gag yang dihasilkan pada sistem ekspresi prokariota E.coli merupakan antigen yang berfungsi sebagai antigen eksogen. Fusi protein VP22 diharapkan dapat menghantarkan protein GagHIV1 ke sitoplasma sel sehingga berfungsi sebagai antigen endogen. Fusi protein eGFP berperan sebagai marker fluoresen untuk analisis lokalisasi protein sebagai pembuktian secara in vitro bahwa protein rekombinan VP22-eGFP mampu berpenetrasi dan masuk ke dalam sel vero. Metodologi: Sekuens VP22, GagHIV1, dan eGFP diinsersikan ke dalam plasmid pQE80L melalui proses transformasi. Protein rekombinan eGFP, VP22-eGFP, GagHIV1-eGFP, dan VP22-GagHIV1-eGFP diklona dan diekspresikan pada sistem E.coli. Proses purifikasi protein rekombinan dilakukan dengan metode Ni-NTA [QIAGEN]. Lokalisasi protein rekombinan dianalisis dengan menggunakan mikroskop fluoresen konvensional dan konfokal. Hasil: Konstruksi plasmid rekombinan pengekspresi protein eGFP, VP22-eGFP, GagHIV1-eGFP, dan VP22-GagHIV1-eGFP telah berhasil diperoleh dan keakuratan susunan basa nukleotida telah dibuktikan dengan metode sekuensing DNA. Hasil sekuens DNA memperlihatkan open reading frame yang sesuai untuk ekspresi protein rekombinan target. Ekspresi protein rekombinan GagHIV1-eGFP dan VP22-GagHIV1-eGFP dengan sistem E.coli belum berhasil diperoleh, kemungkinan disebabkan oleh ukuran protein yang besar (>60 kDa). Sedangkan protein rekombinan eGFP (31,38 kDa) dan VP22-eGFP (27,02 kDa) telah berhasil diekspresikan dan dipurifikasi. Analisis lokalisasi protein rekombinan VP22-eGFP menunjukkan terdapat fluoresen hijau di sitoplasma dan nukleus sel vero. Sedangkan protein rekombinan eGFP tidak ditemukan fluoresen di dalam sel vero. Kesimpulan: Ekspresi protein rekombinan GagHIV1-eGFP dan VP22-GagHIV1-eGFP dengan sistem E.coli masih perlu dioptimasi. Protein rekombinan VP22-eGFP pada penelitian ini dibuktikan dapat berpenetrasi ke sitoplasma dan inti sel vero. Selain vaksin GagHIV1, plasmid rekombinan pQE80L-eGFP dan pQE80L-VP22-eGFP yang diperoleh pada penelitian ini juga berpotensi untuk pengembangan vaksin sub unit eksogen virus lainnya yang ingin diubah menjadi bersifat endogen.

---

Background: HIV-1 vaccine based Gag protein is expected to stimulate the immune response of CD8 + T cells (cytotoxic). Gag protein produced in E.coli prokaryotic expression system serves as an exogenous antigen. Fusion of VP22 protein is expected to deliver Gag HIV1 proteins to the cytoplasm of cell thus functions as an endogenous antigen. Fusion of eGFP protein is performed as a fluorescent marker for localization analysis conducted as the in vitro evidence of VP22-eGFP recombinant protein ability to penetrate and get into vero cell cytoplasm. Methodology: Sequence of VP22, Gag HIV1, and eGFP is inserted into pQE80L plasmid through the transformation method. The eGFP, VP22-eGFP, GagHIV1-eGFP, and VP22-GagHIV1-eGFP recombinant proteins were cloned and expressed in E. coli system. Recombinant protein purification process was conducted using Ni-NTA [QIAGEN]. Localization of recombinant proteins were analyzed using conventional fluorescence and confocal microscopy. Results: Construction of a recombinant plasmid encoding eGFP, VP22-eGFP, GagHIV1-eGFP, and VP22-GagHIV1-eGFP proteins has successfully obtained and the accuracy of the nucleotide base composition has been demonstrated by DNA sequencing. The results of the DNA sequence showed an open reading frame corresponding to the target recombinant protein expression. Expression of GagHIV1-eGFP and VP22-GagHIV1-eGFP recombinant proteins in E. coli system has not successfully obtained, probably due to the large size of the protein (> 60 kDa). While the recombinant protein VP22-eGFP (31,38 kDa) and eGFP (27,02 kDa) was successfully expressed and purified. Localization analysis of VP22-eGFP recombinant protein performs green fluorescent in cytoplasm and nucleus of vero cells. While eGFP recombinant protein in vero cell was not performs green fluorescent. Conclusion: Expression of GagHIV1-eGFP and eGFP-VP22-GagHIV1 recombinant protein in E.coli system still need to be optimized. The VP22-eGFP recombinant protein in this study indicates can penetrate to the cytoplasm and nucleus vero cells. Besides Gag HIV1 vaccines, pQE80L-eGFP and pQE80L- VP22-eGFP recombinant plasmids in this study can be utilized for the development of other viruses exogenous subunit vaccines which would be turned into endogenous.

Abstrak :
Telah dilakukan penelitian yang bertujuan menganalisis DNA genom 118 generasi pertama (T0) dengan metode Southern hybridization dan 549 generasi kedua (T1) dengan metode PCR dan uji seleksi pada tanaman padi (Oryza sativa L.) hasil transformasi T-DNA yang mengandung transposon Ac/Ds pembawa activation tag, melalui metode infeksi Agrobacterium tumefaciens L. dengan plasmid pMO22. Penelitian dilakukan di Laboratorium Biologi Molekuler, Pusat Penelitian Bioteknologi, LIPI, Cibinong selama 10 bulan (Agustus 2007--Mei 2008). Analisis Southern hybridization menunjukkan 9 dari 46 tanaman T0 mengandung single copy T-DNA. Generasi T1 yang diperoleh dari 9 parental (T0) yaitu sebanyak 549 tanaman. Analisis aktivitas transposon Ds pada 161 tanaman T1 dari 5 parental T0 dengan PCR eksisi menunjukkan 110 tanaman memiliki aktivitas transposon Ds. Keberadaan transposon Ac/Ds pada genom tanaman T1 dideteksi dengan penanda reporter gen gfp, bar, dan hpt. Uji GFP tidak berhasil mendeteksi gen gfp dalam transposon Ds karena ekspresi gen tersebut lemah. Uji seleksi basta dan uji higromisin pada 161 tanaman T1 dari 5 parental T0 menunjukkan 78 tanaman mutan yang mengandung transposon Ds stabil (tidak mengandung transposon Ac). Penelitian berhasil membuktikan sistem transposon Ac/Ds dapat digunakan untuk memperoleh populasi tanaman padi mutan yang mengandung transposon Ds stabil pembawa activation tag, dengan posisi yang berbeda-beda.