"SARS-CoV-2 merupakan penyebab merebaknya COVID-19. RT-qPCR merupakan metode deteksi SARS-CoV-2 berdasarkan sekuen gen target, seperti gen nsp14. Saat ini, deteksi yang ada di Indonesia bersifat kualitatif dan belum berfokus pada pengukuran kuantitatif virus berupa jumlah virus. Informasi jumlah virus bermanfaat dalam pengontrolan transmisi, perkembangan penyakit, dan penelitian obat. Maka, pada penelitian ini dikembangkan viral load assay dengan mengkonstruksi kurva standar. Pertama, dilakukan antara primer HKU-ORF1b-nsp14 dengan isolat Indonesia. Setelah itu, dilakukan penyisipan gen nsp14 ke pBluescript II KS(-), ditransformasikan ke E. coli BL21(DE3), diseleksi dengan ampisilin, dipurifikasi, lalu dilinearkan untuk memperoleh DNA standar. Sebagai perbandingan DNA standar, diperoleh RNA standar dari hasil linearisasi dan transkripsi secara in vitro. Kedua standar kemudian dikuantifikasi menggunakan NanoDrop, lalu dibuat pengenceran bertingkat dari 107-102 copy number/µL untuk diamplifikasi menggunakan RT-qPCR berbasis SYBR Green. Dari hasil pengembangan, diketahui bahwa primer yang digunakan memiliki >99% kecocokan dengan isolat dan varian yang berada di Indonesia. Selanjutnya, diperoleh kurva standar DNA dengan persamaan y=-3,56x+36,41 (r=0,9999) yang menghasilkan nilai Ct value lebih rendah dari kurva standar RNA dengan persamaan y=-3,52x+39,87 (r=0,9999). Kurva standar DNA yang dikonstruksi juga memenuhi persyaratan nilai slope, efisiensi, dan koefisien korelasi sehingga dapat digunakan sebagai alternatif dalam viral load assay untuk kuantifikasi titer virus.
COVID-19 is caused by SARS-CoV-2. RT-PCR is used to detect SARS-CoV-2 by targeting gene sequences, such as nsp14. Presently, RT-PCR detection is used qualitatively, while, in contrast, it could be used quantitatively (determining viral load). Viral load information could help in controlling transmission, disease’s severity, and drug discovery. Therefore, this study will establish standard DNA for the development of viral load assay. First, HKU-ORF1b-nsp14 primers were aligned with Indonesian isolate sequences. Then, nsp14 gene is inserted into pBluescript II KS(-), transformed into E. coli BL21(DE3), selected with ampicillin, purified, and linearized to obtain standard DNA. To compare, standard RNA will be established from the linearized DNA and performed in vitro transcription. Both standards were quantified using NanoDrop, performed serial dilutions (107-102 copy number/µL), and amplified using SYBR Green-based RT-qPCR. From this experiment, it is proven that HKU-ORF1b-nsp14 primers is compatible (>99%) with Indonesian isolate and variants. The DNA standard curve obtained was with the equation y=-3,56x+36,41 (r=0,9999) with lower Ct value than RNA standard curve with the equation y =-3,52x+39,87 (r=0,9999). This construction of DNA standard curve has attained optimal standard curve parameters from the slope, efficiency, and correlation coefficient to be used as an alternative in quantifying viral titer."
