Hasil Pencarian  ::  Simpan CSV :: Kembali

"Ruang Lingkup dan Cara Penelitian:Infertilitas terjadi pada 15% pasangan suami istri di seluruh dunia. Penyebab iniertilitas bermacam-macam, salah satunya adalah astenozoospermia. Motilitas spermatozoa merupakan proses yang memerlukan ATP. Molekul ini dihasilkan oleh mitokondria dan keluarnya ATP dari mitokondria ke sitoplasma diatur oleh kanal Voltage-Dependent Anion Channel (VDAC). VDAC adalah kanal ion yang terdapat pada membran luar mitokondria, ditemukan pada berbagai spesies dan tersebar di berbagai jaringan tubuh. Saat ini diketahui terdapat tiga isoform VDAC pada manusia, yaitu hVDAC1, hVDAC2 dan hVDAC3. Melalui penelitian knock-out mouse oleh Sampson et al. (2001), mencit mutan VDAC3 (-1-) mengalami penurunan motilitas spermatozoa apabila dibandingkan dengan mencit wild type. Tujuan penelitian tesis ini adalah untuk menganalisis exon 8 gen hVDAC3 pada spermatozoa yang mempunyai motilitas rendah dari pasien infertil astenozoospermia. Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah DNA spermatozoa yang diperoleh dari 32 pria astenozoospermia dan dari tiga pria fertil normozoospermia. Sampel semen tersebut mula-mula di-swim up untuk memisahkan antara sperma bermotilitas baik dan sperma bermotilitas rendah. Setelah itu DNA sperma diisolasi dan diamplifikasi dengan metode Polymerise Chain Reaction (PCR), dengan menggunakan primer yang spesifik untuk exon 8 gen hVDAC3, Setelah itu dielektroforesis dan disekuensing untuk dianalisis adanya mutasi.Hasil dan Kesimpulan Penelitian:Hasi1 amplifikasi DNA spermatozoa dengan primer spesifik exon 8 genVDAC3 dideterminasi dengan terlihatnya pita DNA berukuran 513 bp. Satu pasien (A32) tidak menampakkan pita, sedangkan hasil elektroforesis 13-aktin sampel A32 menunjukkan adanya pita. Setelah disekuensing, ditemukan satu pasien (A3) yang mengalami rnutasi substitusi berupa substitusi satu nukleotida dari A men]adi C, namun tidak menyebabkan perubahan asam amino. Satu pasien (A4) ditemukan mengalami rnutasi insersi satu nukleotida T. Kesimpulan yang dapat diambil dari penelitian ini adaiah tiga pasien dari 32 pasien astenozoospermia yang diteliti mengalami mutasi pada gen hVDAC3 ekson 8, yaitu mutasi substitusi sebanyak sate sampel, mutasi insersi sebanyak satu pasien dan mutasi delesi sebanyak satu pasien. Pada penelitian ini ditemukan adanya mutasi pada gen hVDAC3 exon 8 pada sperma bermotilitas rendah pasien infertil astenozoospermia."

"Ruang Lingkup dan CaraInfertilitas pada pria merupakan masalah yang perlu ditangani secara bersama-sama dengan infertilitas pada wanita. Salah satu parameter yang berperan dalam fertilitas pria adalah motilitas spermatozoa. Motilitas sperma berperan penting dalam kesanggupan sperma untuk mencapai sel telur (ovum). Oleh karena itu gangguan mortilias sperma sering menjadi penyebab infertilitas pada pria. Pasien dengan masalah ini dikategorikan astenozoospermia. Astenompspermia dapat terjadi akibat disfungsi pada mitokondria, Voltage dependent anion channel (VDAC) merupakan kanal ion yang terdapat pada membran luar mitokondria, bertanggung jawab etas keluar masuknya ATP. Sampai saat ini telah diidentifikasi 3 tipe VDAC dengan tingkat homologi yang tinggi. Berdasarkan penelitian Sampson et al., 2001 dengan menggunakan teknik Knock-out mouse menunjukan bahwa sperma dari mencit mutan dengan delesi 4 ekson terakhir VDAC3 mengalami penuruanan dalam mortalitasnya serta penelitian dari Asmarinah et al (2004) bahwa pada exon 6 gen VDAC3 terdapat mutasi substitusi nukleotida. Hal ini menimbulkan pertanyaan apakah pada exon 7 gen VDAC3 juga terdapat mutasi? Penelitian ini bertujuan untuk menganalisis exon 7 gen VDAC3 pada sperma pasien astenozoospermia. Penelitian ini terdiri dari beberapa tahap, tahap awal adalah pengumpulkan sampel sperma pasien astenozoospermia sebanyak 32 sampel setelah dilakukan swim up dan isolasi DNA. Tahap berikutnya amflifikasi dengan metode PCR dengan primer spesifik untuk ekson 7 gen VDAC3 dan tahap akhir sekuensing DNA dari produk PCR untuk mendeteksi adanya mutasi.Hasil dan kesimpulanDari 32 sampel terlihat adanya hasil amplifikasi fragmen exon 7 gen hVDAC3 yang berukuran kurang lebih 551 pb dan dari hasil sekuensing ditemukan 3 macam mutasi, yaitu mutasi delesi pada 4 sampel (13,33%), mutasi substitusi 1 sampel (3,33 %) yang menyebabkan perubahan asam amino pada posisi 228 dar asam aspartat menjadi asparagine dan mutasi insersi pada 1 sampel (3,33 %) yang mengubah susunan asam amino pada posisi 228."

"ABSTRAKPendahuluan. VDAC merupakan protein kanal ion yang bertanggung jawab atas aliran ion Ca2+ dan ATP dalam flagela spermatozoa. Defisiensi gen VDAC3 pada mencit dan mutasi gen VDAC3 pada manusia menyebabkan penurunan motilitas spermatozoa, sehingga VDAC3 dapat dijadikan antigen potensial untuk pengembangan vaksin kontrasepsi laki-laki. Tujuan penelitian ini adalah memproduksi protein rekombinan hVDAC3 dari gen hVDAC3 ekson 5-8 spesifik spermatozoa, dan digunakan sebagai antigen untuk produksi antibodi poliklonal pada kelinci.Metode. Gen hVDAC3 ekson 5-8 spermatozoa diperoleh melalui RT PCR, gen disisipkan ke plasmid pET100/D-TOPO dan diklona dalam E coli TOP 10. Analisis gen sisipan dengan PCR, enzim restriksi dan sekuensing DNA. Protein rekombinan hVDAC3 diekspresikan dalam E coli BL21 StarTM (DE3). Karakterisasi protein dilakukan dengan uji Bradford, SDS PAGE, western blot dan purifikasi protein dengan resin Ni-NTA. Antibodi poliklonal diperoleh dengan cara imunisasi protein rekombinan hVDAC3 ke kelinci dan diukur dengan indirect ELISA. Determinasi lokasi hVDAC3 di spermatozoa dengan metode immunoflurosence.Hasil. Amplifikasi PCR gen hVDAC3 ekson 5-8 berukuran 435 pb dan analisis BLAST menunjukkan 100% identik dengan gen VDAC3 manusia dari bank gen. Vektor rekombinan berukuran 6195 pb mengekspresikan protein rekombinan hVDAC3 berukuran 20 kDa. Antibodi poliklonal telah diproduksi kelinci secara bermakna (p<0.05) dengan titer 2.817, dan antibodi dapat berikatan dengan protein hVDAC3 di kepala dan flagela spermatozoa. Selanjutnya, antibodi poliklonal ini akan digunakan dalam pengembangan vaksin kontrasepsi pada laki-laki.

---

ABSTRACT

Introduction. Voltage dependent anion channels (VDAC), also known as mitochondrial porins, are group of proteins in mitochondrial outer membrane that allow the passage of metabolites across the mitochondrial outer membrane, and are involved in ions and ATP transport in sperm flagella. Deficiency and mutation of VDAC3 may cause abnormality in structure and motility of human spermatozoa. VDAC3 could be a potential target to develop non hormonal male contraceptive vaccine. The objective of the study was to produce hVDAC3 recombinant proteins from exon 5 to 8 of human sperm VDAC3 spesific gene.

This recombinant protein was subsequenly used as an antigen to produce polyclonal antibodies in rabbits. Methods. hVDAC3 sperm gene obtained by RT PCR, this gene was inserted into plasmid pET 100/D-TOPO and cloned in E coli TOP 10. The gene was analyzed by PCR method, restriction enzymes and DNA sequencing. The proteins expressed in E coli BL21 StarTM (DE3). Characterization of proteins was evaluated by Bradford method, SDS PAGE and western blot. The recombinant protein was purified with NI-NTA resin. Polyclonal antibodies were obtained by immunization of hVDAC3 recombinant protein into rabbits. Indirect ELISA was done to analyze the antibody. Localization of the VDAC3 recombinant protein in human spermatozoa was evaluated by immunofluorescence method.

Result. By doing PCR amplification and BLAST analysis, the study showed that the hVDAC3 gene had 100% identical to hVDAC3 genes in data bank. E coli BL21 StarTM (DE3) containing recombinant vector (6195 bp) expressed the recombinant protein of hVDAC3 in 20 kDa. This protein produced polyclonal antibodies that bound VDAC3 protein on the head and flagella of human spermatozoa."

"Latar Belakang. Voltage Dependent Anion Channel3 (VDAC3) merupakan salah satu protein yang terdapat pada sperma. Pada pengembangan imunokontrasepsi, protein tersebut dapat dijadikan antigen potensial dalam menurunkan fungsi sperma. Beberapa penelitian menunjukan bahwa anti-VDAC dapat mengganggu fungsi normal dan meningkatkan abnormalitas morfologi sperma. Imunisasi protein VDAC3 rekombinan terhadap kelinci diharapkan dapat memicu terbentuknya antibodi poliklonal anti-VDAC3. Antibodi tersebut kemudian dipurifikasi dan dievaluasi kemampuannya dalam mengikat antigen VDAC3 yang terdapat pada sperma manusia melalui pengamatan motilitas, viabilitas, integritas membran, dan integritas akrosom.Metode. Protein rekombinan VDAC3 diproduksi dengan cara mengkultur bakteri E.coli BL21 yang mengandung konstruksi vektor rekombinan. Protein rekombinan tersebut diimunisasikan pada kelinci kemudian diambil antiserumnya. Antibodi VDAC3 yang terkandung dalam antiserum dipurifikasi dengan metode kromatografi afinitas matriks sepharose protein A kemudian konsentrasinya diukur dengan metode ELISA dan dianalisis kemurniannya secara kualitatif dengan SDS-PAGE. Antibodi VDAC3 tersebut kemudian diuji kemampuannya terhadap sperma manusia normal dengan parameter: motilitas, kecepatan pergerakan, mortalitas (menggunakan metode pewarnaan Eosin Y), integritas membran ekor (menggunakan metode HOST), dan integritas akrosom (menggunakan metode FITC-PNA).Hasil. Kultur biakan E. coli dengan penambahan IPTG menunjukkan konsentrasi protein terlarut lebih tinggi yaitu 2,051 mg/ml dibandingkan dengan tanpa IPTG yaitu 1,528 mg/ml. Imunisasi protein VDAC3 rekombinan terhadap kelinci menghasilkan antiserum yang mengandung antibodi antiVDAC3 dengan titer tertinggi yaitu 3,504 pada kelinci B. Hasil SDS-PAGE antibodi yang dimurnikan menunjukan dua pita yang mendekati ukuran ~ 55 kDa dan ~25 kDa. Analisis statistik dari pengaruh antibodi VDAC3 murni terhadap motilitas, kecepatan gerakan, mortalitas, integritas membran ekor dan integritas akrosom sperma menunjukkan perbedaan yang signifikan (p <0,05) dengan kontrol preimun serum.

---

ABSTRACTBackground. Voltage Dependent Anion Channel 3 (VDAC 3) is one of the proteins found in sperm. On the development of immunocontraception, this protein can be used as potential antigens to reduce normal function of sperm. Several studies have shown that anti-VDAC can reduce normal function of sperm and also increase the morphological abnormalities of sperm. VDAC3 recombinant protein immunization to rabbit is expected to produce of polyclonal antibodies anti-VDAC3. Then, the antibodies are purified and evaluated its ability to bind antigen VDAC3 contained in human sperma by observation of motility, sperm speed, viability, membrane integrity, and the integrity of the acrosome.Method. VDAC3 recombinant protein produced by culturing of E. coli BL21 that contains the construction of recombinant vector. This recombinant protein immunized to rabbits and then the antiserum taken from blood sample. VDAC3 antibodies that contained in antiserum purified by affinity chromatography matrix protein A Sepharose then the concentration was measured by ELISA and the purity analyzed by SDS-PAGE. The ability of VDAC3 antibodies were then tested to normal human sperma with parameters are: sperm motility, sperm speed, mortality (eosin Y staining method), membrane integrity (using HOST), and the integrity of the acrosome (using FITC-PNA).Results. Culture of E. coli with addition of IPTG showed a higher concentrations (2,051 mg/ml) than without IPTG (1,528 mg/ml). Immunization of protein VDAC3 recombinant to rabbit produce antiserum that contains antibodies with the highest titers 3,504 in rabbit B. SDS-PAGE analysis two protein fragmen with size of ~ 55 kDa and ~ 25 kDa. Statistical analysis of the effect of pure VDAC3 antibodies to motility, sperm speed, mortality, membrane integrity, and the integrity of the acrosome showed a significant difference (p < 0.05) with control preimun serum."

"Pendahuluan: VDAC merupakan saluran ion pada spermatozoa yang berperan penting dalam pengangkutan ATP, ion, dan metabolit di dalam membran sel. Telah diketahui VDAC3 berperan dalam motilitas sperma. Tujuan dari penelitian ini adalah memproduksi antibodi anti-VDAC3 melawan protein rekombinan hasil ekspresi vektor rekombinan VDAC3 dan menguji efeknya terhadap viabilitas dan motilitas sperma ejakulat manusia.Metode: Protein rekombinan VDAC3 diimunisasikan selama 14 minggu ke 2 ekor kelinci. Kemudian serum kelinci minggu ke -6 diuji dengan metode ELISA untuk mengetahui titer antibodi anti-VDAC3 dalam serum dan serum preimun sebagai kontrolnya. Serum mengandung antibodi anti-VDAC3 dan serum preimun dipaparkan terhadap 22 sampel ejakulat sperma manusia dan dilihat efeknya terhadap parameter motilitas sperma, Velocity Average Path (VAP), Curvilinear Velocity (VCL), dan Velocity Average Path (VAP) dengan menggunakan Computer Assisted Sperm Analysis (CASA), serta uji viabilitas sperma dengan pewarnaan Eosin-Y pada 0, 30, dan 60 menit paparan.Hasil: Terdapat perbedaan bermakna viabilitas sperma ejakulat manusia yang dipapar dengan serum antibodi anti-VDAC3 dibandingkan dengan serum preimun dalam waktu 0, 30, dan 60 (p=0,001). Selain itu, terdapat perbedaan presentase motilitas sperma ejakulat yang dipapar dengan serum antibodi anti-VDAC3 dibandingkan dengan serum preimun dalam waktu 0 dan 30 menit (p=0,007; 0,001), sedangkan pada waktu 60 menit tidak bermakna (p=0,062). Pengujian terhadap parameter motilitas VAP, VSL, dan VCL, tidak menunjukkan perbedaan bermakna (p>0,05).Kesimpulan: Serum antibodi anti-VDAC3 rekombinan dapat menurunkan viabilitas dan motilitas sperma ejakulat manusia

---

Introduction: VDAC is an ion channel in spermatozoa that plays an important role in the transport of ATP, ions and metabolites in the cell membrane, play a role in sperm motility. The aim of this study was to produce anti-VDAC3 antibodies against VDAC3 recombinant protein that expressed in E coli and evaluated their effect on viability and motility parameters of human ejaculate sperm.

Methods: The VDAC3 recombinant protein produced then immunized for 14 weeks to 2 rabbits. The VDAC3 antiserum on 6 weeks was tested by ELISA method to determine the VDAC3 antibody titer in serum and preimmune serum as control. Then, this antiserum and preimmune serum were exposed to 22 samples of human sperm ejaculate and evaluated the effect on viability parameters with Eosin-Y staining, percentage of motility, VAP, VCL, and VSL using computer assisted sperm analysis for 0, 30, and 60 minutes of exposure.

Results: There were a significant difference in the viability of human ejaculate sperm exposed to anti-VDAC3 antiserum compared to preimmune serum at 0, 30, and 60 minutes (p = 0.001). In addition, there were a significant difference in the percentage of motility of ejaculated sperm that was exposed by anti-VDAC3 antiserum compared to preimmune serum at 0 and 30 minutes (p = 0.007; 0.001; respectively). Furthermore, percentage of motility of ejaculated sperm that was exposed by anti-VDAC3 antiserum compared to preimmune serum at 60 minutes and the effect of antiserum on the VAP, VSL, and VCL parameters did not show any difference (p>0.05).

Conclusions: Anti-VDAC3 antibody could reduce ejaculated sperm motility parameters and decrease ejaculated sperm living cells"

"Penelitian mengenai metode solubilisasi dan refolding protein rekombinan hVDAC3 ekson 5?8 dari badan inklusi telah dilakukan. Penelitian bertujuan menganalisis dan membuktikan hubungan antara perlakuan deterjen LDAO dan lama waktu inkubasi terhadap perolehan konsentrasi protein rekombinan hasil solubilisasi dan refolding. Solubilisasi dilakukan dengan penambahan 6 M guanidin HCl sedangkan refolding dilakukan dengan perlakuan berbagai konsentrasi deterjen LDAO sebesar 0.5%, 1.0%, 1.5%, 2.0%, dan 2.5% serta perlakuan berbagai waktu inkubasi selama 0 jam, 24 jam, 48 jam, 72 jam, 96 jam, 120 jam, 144 jam, dan 168 jam. Setiap perlakuan dilakukan untuk mempertahankan protein rekombinan hVDAC3 dalam kondisi terlarut tanpa kembali membentuk protein agregat. Protein rekombinan hVADC3 tidak larut dalam badan inklusi diperoleh dari kombinasi sistem ekspresi antara plasmid pET100/D-TOPO dan Escherichia coli strain BL21 StarTM (DE3) dengan induksi ekspresi 1 mM IPTG.Pilot project dilakukan untuk mengukur konsentrasi protein relatif menggunakan OD280 dan konsentrasi protein total menggunakan metode Bradford sebagai indikator perolehan protein terlarut hasil solubilisasi dan refolding. Perolehan protein rekombinan hVDAC3 hasil solubilisasi dan refolding dikonfirmasi secara kualitatif dengan metode western blotting dan secara kuantitatif dengan metode ELISA. Perlakuan deterjen LDAO terhadap perolehan konsentrasi protein total berbeda signifikan (p < 0.05), memiliki korelasi yang signifikan (p < 0.05), dengan nilai koefisien korelasi (R2) linear sebesar 0.884 dan arah korelasi bernilai positif. Dengan demikian perlakuan deterjen LDAO berpengaruh sangat kuat terhadap konsentrasi protein total. Semakin tinggi konsentrasi deterjen LDAO yang diberikan maka semakin tinggi pula konsentrasi protein total yang diperoleh. Perlakuan waktu inkubasi terhadap perolehan konsentrasi protein total tidak berbeda signifikan (p > 0.05), tidak memiliki korelasi yang signifikan (p > 0.05), dengan nilai koefisien korelasi (R2) linear sebesar 0.003 dan arah korelasi tidak terdefinisi. Dengan demikian perlakuan waktu inkubasi tidak berpengaruh terhadap konsentrasi protein total. Semakin lama waktu inkubasi yang dilakukan tidak memengaruhi perolehan konsentrasi protein total. Analisis kualitatif menunjukkan bahwa ukuran protein rekombinan hVDAC3 sebesar 25 kDa sedangkan analisis kuantitatif pada perlakuan deterjen LDAO 0.5% dan 2.5% dengan waktu inkubasi 24 jam berurutan sebesar 36.951 ± 5.679 dan 53.197 ± 23.694 µg/ml volume kultur.

---

Research about method for solubilization and refolding insoluble recombinant protein hVDAC3 exon 5?8 from inclusion bodies has been done. The research aims to analyze and prove the relationship between LDAO detergent treatment and incubation time with protein concentration after solubilization and refolding process. Solubilization is carried out with the addition of 6 M Guanidine HCl whereas refolding with various concentrations of LDAO (0.5%, 1.0%, 1.5%, 2.0%, and 2.5%) and various time incubation (0, 24, 48, 72, 96, 120, 144, and 168 hours). Each treatment was done to maintain recombinant protein hVDAC3 in soluble state without reforming protein aggregates. Insoluble recombinant protein hVDAC3 exon 5?8 in inclusion bodies obtained from a combination plasmid pET100/D-TOPO and Escherichia coli strain BL21 StarTM (DE3) expression system with 1 mM IPTG for induction. Pilot project to measure the relative protein concentration using OD280 and total protein concentration using Bradford method as an indicator of protein amount that remained in solution after refolding. The acquisition of recombinant protein hVDAC3 after solibilization and refolding process confirmed qualitatively by western blotting and quantitatively by ELISA method. LDAO detergent treatment for total protein concentration is significant different (p < 0.05), had a significant correlation (p < 0.05), with a value of correlation coefficient (R2) 0.884 and positive direction of linear correlation. Thus the LDAO detergent treatment very strong influence on the total protein concentration. The higher concentration of LDAO detergent given the higher total protein concentrations were obtained. Incubation time treatment for total protein concentration did not differ significantly (p > 0.05), no significant correllation (p > 0.05), with a value of correlation coefficient (R2) 0.003 and a linear correlation direction is undefined. Thus incubation time treatment did not effect on total protein concentration. The longer incubation time do not effect the acquisition of the total protein concentration. Qualitative analysis showed the hVDAC3 recombinant protein was detected at 25 kDa while quantity of hVDAC3 recombinant protein for 0.5% and 2.5% LDAO concentration treatment with 24 hours incubation time consecutively 36.951 ± 5.679 and 53.197 ± 23.694 µg/ml culture volume."

"Latar belakang: Tujuan penelitian ini adalah untuk membuat konstruksi vektor rekombinan gen Voltage-Dependent Anion Channel isoform 3 (VDAC3) spesifik sperma manusia, untuk produksi antibody VDAC3 yang berpotensi sebagai bahan kontrasepsi laki-laki.Metode: Fragmen target untuk pembuatan vektor rekombinan adalah gen VDAC3 spesifik sperma manusia, yang diperoleh dengan cara mengamplifikasi cDNA dari sperma manusia melalui metode PCR menggunakan primer spesifik gen VDAC3 exon 5 sampai dengan exon 8. Vektor rekombinan gen VDAC3 dikonstruksi dengan cara mengklon produk PCR tersebut (435 pb) ke vektor ekspresi pET101/D-TOPO (5753 pb). Selanjutnya bakteri E. coli TOP10 ditransformasi dengan vektor rekombinan di atas. Hasil klon gen VDAC3 pada vektor dikonfirmasi dengan pemotongan vektor rekombinan dengan enzim restriksi XbaI dan metode PCR colony pada bakteri yang tumbuh dengan menggunakan primer VDAC3 exon 5-8.Hasil: Analisis BLAST dari amplifikasi gen VDAC3 sperma manusia dengan primer spesifik exon 5 sampai exon 8 menunjukkan 94% identik dengan data gene bank. Bakteri E. coli transforman yang berhasil tumbuh ada 12 klon. Hasil elektroforesis vektor rekombinan VDAC3 yang telah dipotong dengan enzim restriksi XbaI, dari 12 klon yang tumbuh menunjukkan pita berukuran 6181 pb pada 8 klon bakteri. Setelah dilakukan metode PCR colony diperoleh pita berukuran 435 pb selanjutnya setelah disekuensing diperoleh sekuen amplicon yang 94% identik dengan gen VDAC3 manusia.Kesimpulan: Penelitian ini berhasil membuat konstruksi vektor rekombinan gen VDAC3 spesifik untuk sperma manusia, untuk pengembangan bahan kontrasepsi laki-laki di masa datang.

---

AbstractBackground: The aim of this study was to construct a recombinant vector of human sperm specific VDAC3 gene for production of VDAC3 antibody, which is potential as male contraception vaccine.Methods: Target fragment sequence of VDAC3 gene was obtained through amplification of human sperm VDAC3 cDNA with primers covering exon 5 to exon 8. Its PCR product in size of 435 bp was cloned to the pET101/D-TOPO expression vector (5753 bp). E. coli bacteria were transformed with this vector. Cloning of VDAC3 fragment gene to the vector was confirmed by the using of XbaI restriction enzyme and PCR colony method with primers covering exons 5-8 of the human VDAC3 gene.Results: Alignment analysis of amplified fragment covering exon 5 to exon 8 of VDAC3 gene showed 94% homology to human VDAC3 gene from databank. After cloning to the expression vector and transformation to E. coli competent cells, twelve colonies could grow in culture media. Gel electrophoresis of sliced VDAC3 recombinant vector showed a single band in the size of 6181 bp in 8 colonies. After application of PCR colony and amplicon sequencing, the result showed a single band in the size of 435 bp and fragment sequence with 94% identity to human VDAC3 gene.Conclusion: The construction of human sperm specific VDAC3 gene recombinant vector was established in this study. In the future, this recombinant vector will be used to produce VDAC3 antibody for the development of a male contraception vaccine."

"ABSTRAKLatar Belakang. Protein yang berperan penting dalam fungsi sperma berpotensi sebagai target molekul dalam upaya pengembangan bahan kontrasepsi pria. Salah satu protein yang terdapat pada sperma adalah protein kanal Voltage Dependent Anion Channel3 (VDAC3). VDAC3 berfungsi mengatur aliran ion dan metabolit termasuk ATP. Dari penelitian dengan menggunakan teknik knock-out mouse pada gen VDAC3 dilaporkan bahwa mencit jantan mutan VDAC3 homozigot mengalami penurunan yang signifikan dalam motilitas spermanya. Tujuan penelitian ini adalah memproduksi antibodi poliklonal VDAC3 melalui imunisasi protein rekombinan VDAC3 murni dan uji aktivitasnya terhadap motilitas dan viabilitas sperma manusia.Metode. Verifikasi keberhasilan pemotongan His fussion tag beserta 31 asam amino plasmid dari protein rekombinan dilakukan dengan teknik Western blott. ELISA digunakan untuk mengetahui titer IgG anti VDAC3sedangkan uji efektifitas antibodi VDAC3 terhadap fungsi sperma dilakukan dengan menghitung prosentase sperma yang tidak bergerak, waktu yang ditempuh sperma dalam jarak 0,1 mm. Analisa viabilitas sperma dilakukan dengan metode pewarnaan eosin.Hasil. Pada penelitian ini Western blotting dengan menggunakan antibodi Rabbit Anti VDAC Human menghasilkan pita tunggal dengan ukuran ~ 16 kDa, sedangkan penggunaan antibodi terhadap His (C-term) tidak menunjukan adanya pita. Hasil spektofotometri ELISA titer antibodi poliklonal VDAC3 yang berasal dari kelinci menunjukkan adanya peningkatan titer antibodi poliklonal VDAC3 setelah imunisasi dibandingkan dengan titer antibodi sebelum imunisasi (preimun serum). Hasil uji aktivitas antibodi poliklonal VDAC3 menunjukkan terjadi peningkatan jumlah sperma bergerak yang bermakna pada waktu 30 menit (p<0,05) dan 60 menit (p<0,05), juga terjadi peningkatan waktu tempuh sperma yang bermakna pada waktu 0-30 menit (p<0,05) setelah perlakuan. Penambahan antibodi poliklonal VDAC3 juga berpengaruh secara nyata terhadap persentase viabilitas spermatozoa yang hidup (p<0,05).Kesimpulan. VDAC3 poliklonal antibodi berhasil diproduksi melalui imunisasi dari VDAC3 rekombinan murni. Antibodi poliklonal anti-protein rekombinan Voltage Dependent Anion Channel-3 (VDAC3) dapat menurunkan motilitas dan viabilitas sperma manusia invitro secara bermakna.

---

ABSTRACT

Background. Sperm-specific proteins that are important for sperm function can potentially be used as a target for developing a male contraceptive. One of the proteins found in the human sperm is Voltage Dependent Anion Channel3 (VDAC3). VDAC3 regulates the flow of ions and metabolites including ATP in the mitochondrial membrane and cell membrane of the eukaryotes. A previous study showed VDAC3 knockout mice had significant reduction in sperm motility. The purpose of this study was to produce polyclonal antibodies through immunization of pure VDAC3 recombinant protein and analyze its effect towards sperm motility and viability.

Methods. Removal of the His fussion tags plus 31 amino acids from the recombinant plasmid was verified using western immunoblotting. The titter of VDAC3 polyclonal antibody was determined by ELISA. The effect of VDAC3 antibodies against sperm qualities namely motility and viability was assessed using standard sperm analyses approved by the WHO.

Results. Western immunoblotting using Rabbit Anti Human VDAC3, produced a single band with size of ~ 16 kDa. No visible band was detected when anti-His (C-term) antibody was used in the analyses. Spectophotometric ELISA showed that the titer of VDAC3 polyclonal antibodies, derived from rabbits, polyclonal antibody increased better than the pre-immune. Analyses of VDAC3 polyclonal antibody against human sperm showed an increase in the number of sperm to move significant at 30 minutes (p < 0.05) and 60 minutes (p < 0.05), as well as an increase in sperm significant travel time at the time of 0-30 minutes (p < 0.05) after treatment. Polyclonal antibodies VDAC3 also significantly affect the percentage of sperm viability (p < 0.05).

Conclusion. Polyclonal antibody anti-VDAC3 was successfully produced via immunization of the pure recombinant VDAC3. Polyclonal antibody anti-recombinant protein Voltage Dependent Anion Channel-3 (VDAC3) may decrease human sperm motility and viability in vitro significantly."

"Ruang Lingkup dan Cara Penelitian : Salah satu penyebab infertilitas pada pria adalah rendahnya motilitas sperma (asthenozoospermia). Motilitas yang rendah ini dapat disebabkan oleh beberapa hal antara lain adanya gangguan pada fungsi mitokondria. Porin atau voltage dependent anion channel (VDAC) merupakan kanal ion dengan berat molekul 30-35 kDa yang terdapat di membran luar mitokondria sel eukariota. Sampai saat ini telah berhasil diidentifikasi 3 tipe porin dengan tingkat homologi yang tinggi. Sebagai kanal ion, porin bertanggung jawab atas keluar masuknya metabolit di dalam sel, termasuk ATP. Porin tidak banya memperantarai transport ATP dari dalam mitokondria bahkan juga mengatur proses keluarnya ATP. Hasil penelitian Sampson et al. (2001) dengan teknik knock out mouse yang mendelesikan 4 exon terakhir gen VDAC3 mencit menyebabkan mencit jantan mutan sehat tapi infertil asthenozoospenmia (Jumlah sperma normal tapi motilitas menurun). Penelitian ini bertujuan untuk menganalisis exon 6 gen VDAC3 manusia pada sperma motilitas rendah dari pasien infertilitas asthenozoospermia dibandingkan dengan sperma motilitas lurus dan cepat (normal). Sperma pasien asthenozoospermia diswim-up dan diambil sperma yang gerakannya lemah. Sedangkan sperma yang normal diswim-up dan diambil sperma yang berenang ke atas (gerakannya baik). Setelah itu dilakukan isolasi DNA dan sperma yang didapat. Jumlah sampel sperma asthenozoospermia adalah 30 sampel, sedangkan sperma normal sebanyak 20 sampel. DNA genom yang sudah didapatkan kemudian di amplifikasi dengan primer yang spesifik untuk exon 6 gen VDAC3. Hasil PCR dielektroforesis dengan gel agarose 2%. Setelah dilakukan sekuensing terhadap produk PCR dari sampel yang ada dengan menggunakan Big Dye Terminator Mix menggunakan musin sekuensing the ABI 377A.Hasil dan Kesimpulan: Dari 30 sampel sperma pasien asthenozoospermia, 28 sampel menunjukkan adanya hasil amplifikasi fragmen exon 6 gen hVDAC3 berukuran + 225 pb dan dari hasil sekuensing ditemukan adanya 4 mutasi substitusi nukleotida yang menyebabkan perubahan asam amino penyusun exon 6 gen bVDAC3 pada 9 sampel, yaitu perubahan asam amino posisi 131 dan isoleusin menjadi leusin sebanyak 8 sampel (26,67%), posisi 174 dari lisin menjadi asam glutamat sebanyak 1 sampel (3,33%), posisi 143 dan valin menjadi glisin sebanyak 1 sampel (3,33%), dan posisi 164 dari leusin menjadi triptofan sebanyak 1 sampel (3,33%). Mutasi ini mungkin dapat menyebabkan gangguan fungsi mitokondria sperma dalam mengeluarkan ATP."

"Ruang Lingkup dan Cara Penelitian :Salah satu penyebab infertilitas pada pria adalah rendahnya motilitas sperma (asthenozoospermia). Motilitas yang rendah ini dapat disebabkan oleh beberapa hal antara Iain adanya gangguan pada fungsi mitokondria. Porin atau voltage dependent anion channel (VDAC) merupakan kanal ion dengan berat molekul 30-35 kDa yang terdapat di membran luar mitokondria sel eukariota. Sampai saat ini telah berhasil diidentifikasi 3 tipe porin dengan tingkat homologi yang tinggi. Sebagai kanal ion, porin bertanggung jawab atas keluar masuknya metabolit di dalam sel, termasuk ATP. Porin tidak hanya memperantarai transport ATP dari dalam mitokondria bahkan juga mengatur proses keluarnya ATP. Hasil penelitian Sampson et al. (2001) dengan teknik knock-out mouse yang mendelesikan 4 exon terakhir gen VDAC3 mencit menyebabkan mencit jantan mutan sehat tapi infertil asthenozoospermia (jumlah sperma normal tapi motilitas menurun).Penelitian ini bertujuan untuk menganalisis exon 6 gen VDAC3 manusia pada sperma motilitas rendah dari pasien infertilitas asthenozoospermia dibandingkan dengan sperma motilitas lurus dan cepat (normal). Sperma pasien asthenozoospermia diswim-up dan diambil sperma yang gerakannya lemah. Sedangkan sperma yang normal diswim-up dan diambil sperma yang berenang ke atas (gerakannya baik). Setelah itu dilakukan isolasi DNA dari sperma yang didapat. Jumlah sampel sperma asthenozoosperrnia adalah 30 sampel, sedangkan sperma normal sebanyak 20 sampel. DNA genom yang sudah didapatkan kemudian di amplifikasi dengan primer yang spesifik untuk exon 6 gen VDAC3. Hasil PCR dielektroforesis dengan gel agarose 2%. Setelah dilakukan sekuensing terhadap produk PCR dari sampel yang ada dengan menggunakan Big Dye Terminator Mix menggunakan mesin sekuensing the ABI 377A.Hasil dan Kesimpulan:Dan 30 sampel sperma pasien asthenozoospermia, 28 sampel menunjukkan adanya hasil amplifikasi fragmen exon 6 gen hVDAC3 berukuran + 225 pb dan dan hasil sekuensing ditemukan adanya 4 mutasi substitusi nukleotida yang menyebabkan perubahan asam amino penyusun exon 6 gen hVDAC3 pada 9 sampel, yaitu perubahan asam amino posisi 131 dan isoleusin menjadi leusin sebanyak 8 sampel (26,67%), posisi 174 dari lisin menjadi asam glutamat sebanyak 1 sampel (3,33%), posisi 143 dari valin menjadi glisin sebanyak 1 sampel (3,33%), dan posisi 164 dan leusin menjadi triptofan sebanyak 1 sampel (3,33%). Mutasi ini mungkin dapat menyebabkan gangguan fungsi mitokondria sperma dalam mengeluarkan ATP."