Hasil Pencarian  ::  Simpan CSV :: Kembali

"ABSTRAKInfeksi yang disebabkan oleh virus dengue telah banyak dilaporkan di negara tropis dan subtropis. Virus dengue terdiri dari 4 serotipe yaitu dengue 1-4. Hingga saat ini belum tersedia vaksin yang berlisensi untuk mencegah terjadinya infeksi dengue. Pada penelitian ini dikonstruksi vaksin DNA yang mengkode gen prM-E dan prM-E-NS1del virus dengue 2 strain Indonesia yang akan dijadikan sebagai kandidat vaksin dengue. Hasil penelitian berhasil mendapatkan 9 plasmid rekombinan pUMDE2 yang membawa gen sisipan prM-E dan telah dikonfirmasi dengan melakukan PCR koloni dan restriksi plasmid. Dari hasil sekuensing plasmid pUMDE2 koloni no. 11 ditemukan 19 mutasi asam amino pada gen prM-E, sepuluh mutasi pada gen prM dan sembilan mutasi pada gen E. Mutasi protein prM N29D dan N52K serta protein E V164I dan S390N terletak pada daerah epitop pengenalan sel B. Transfeksi plasmid pUMDE2 dilakukan pada sel Chinese Hamster Ovary (CHO)-K1 dan menunjukkan adanya ekspresi protein prM-E rekombinan berdasarkan uji imunostaining dan ELISA. Hasil ELISA menunjukkan bahwa protein ditemukan pada sel yang ditransfeksi. Sedangkan, plasmid rekombinan yang membawa gen prM-E-NS1del tidak berhasil dikonstruksi. Plasmid pUMDE2 dapat dikembangkan menjadi kandidat vaksin DNA.

---

ABSTRACT

Infection by dengue virus were reported in tropical and subtropical area. Dengue virus (DENV) consist of 4 serotype, DENV-1 to DENV-4. There is no licensed vaccine available for dengue infection. In this research, we construct DNA vaccine encode prM-E and prM-E-NS1del genes of dengue virus serotype 2 for vaccine development. Nine recombinant plasmids that encode prM-E genes (pUMDE2), were successfully obtained. Recombinant plasmids were confirmed by PCR colony and restriction enzyme analysis. Colony of pUMDE2 no. 11 was sequenced and total 19 amino acid mutations were founds, 10 mutations in prM and 9 mutations in E protein. prM mutations N29D and N52K, E mutations of V164I and S390N were found in B cell epitopes. Transfection pUMDE2 plasmid was done to Chineese Hamster Ovary (CHO)-K1 and showed that recombinant protein prM-E was successfully expressed by immunostaining assay and ELISA. Results showed that the protein was mainly found in cell fraction. However, recombinant plasmid that encode prM-E-NS1del were failed to be constructed. pUMDE2 could be developed for vaccine candidate."

"[ABSTRAKDemam berdarah dengue (DBD) merupakan penyakit yang disebabkan karenainfeksi virus dengue (DENV), yang banyak ditemukan di Indonesia. Belum adaterapi yang spesifik dalam pengobatan DBD. Upaya pengembangan vaksindengue yang efektif sangat diperlukan. Pada penelitian ini dilakukan analisaimunogenisitas kandidat vaksin DNA prM-E dengue serotipe 2 (pUMD2.kl.20)dengan menganalisis sel T CD4, sel T CD8, IFN-γ dan TNF-α. pada sel U937 danPBMC secara in vitro, bertujuan untuk mengetahui respon imun ketika vaksindiinjeksikan ke dalam tubuh manusia. Dasar penelitian ini adalah sel U937ditransfeksi dengan pUMD2.kl.20 menggunakan lipofectamin. Sel U937 akanberperan sebagai APCs yang akan mengekspresikan protein prM-E DENV-2 danmempresentasikan protein tersebut melalui molekul MHC class I dan MHC classII kepada Peripheral Blood Mononuclear Cell (PBMC) manusia. Tahapan kerjayang dilakukan dalam penelitian ini terdiri dari: (a) kultur galur sel U937, (b)transfeksi sel U937 dengan pUMD2.kl.20, (c) transfeksi sel U937 dengan plasmids(pUMVC), (d) infeksi sel U937 dengan DENV-2 strain DS.18/09, (e) pewarnaandan pengamatan hasil pewarnaan menggunakan alat semi flowcytometri (TALI).pUMD2.kl.20 mengaktivasi sel T CD4 dan sel T CD8 untuk berploriferasi. Hasilpenelitian ini menunjukkan bahwa konsentrasi sel T CD8 lebih tinggi darikonsentrasi sel T CD4 dan konsentrasi sel positif yang mensekresikan IFNγ lebihtinggi dari konsentrasi sel positif yang mensekresikan TNFα. Kondisi optimal dariaktivasi sel T CD4 oleh pUMD2.kl.20 adalah 24 jam setelah penambahan PBMCsetelah transfeksi (8,53x10⁴sel/ml), untuk sel T CD8 adalah 24 jam setelahpenambahan PBMC setelah transfeksi (49,4x10⁴ sel/ml). Kondisi optimal dariaktivasi sel+ yang mensekresikan IFNγ oleh pUMD2.kl.20 adalah 24 jam setelahpenambahan PBMC 48 jam setelah transfeksi (9,86x10⁴ sel/ml), dan untuk sel+yang mensekresikan TNFα adalah 2 jam setelah penambahan PBMC 48 jamsetelah transfeksi (2,1x10⁴ sel/ml). Dari penelitian ini dapat disimpulkan bahwapUMD2.kl.20 bersifat imunogenik.

---

ABSTRACTDengue hemorrhagic fever (DHF) is a disease caused by infection with denguevirus (DENV), which is found in Indonesia. There is no specific therapy in thetreatment of DHF. An effort to develop an effective dengue vaccine is needed. Inthis research, analysis of the immunogenicity of the DNA vaccine candidate prMEdengue serotype 2 (pUMD2.kl.20) by analyzing the CD4 T cells, CD8 T cells,IFN-γ and TNF-α in U937 cells and PBMC in vitro, aims to determine theimmune response when the vaccine is injected into the human body. This researchapproach is based on transfection of U937 cells with pUMD2.kl.20 usinglipofectamin. U937 cells acts as APCs which will express the protein prM-EDENV-2 and presenting these proteins through the MHC class I and MHC class IImolecule to the Peripheral Blood Mononuclear Cell (PBMC) of human body.Stages of the work in this study consisted of: (a) culture cell line U937, (b)transfection of U937 cells with pUMD2.kl.20, (c) transfection of U937 cells withplasmid (pUMVC), (d) infection of U937 cells with DENV-2 strains DS.18/09,(e) staining and observation results of staining using a semi-flow cytometri(TALI). pUMD2.kl.20 activate CD4 T cells and CD8 T cells to proliferate. CD8 Tcells concentration higher than the concentration of CD4 T cells and the secretionof INFγ-positive cells concentration higher than the concentration of the secretionof TNFα-positive cells. Optimal condition of CD4 T cells activation bypUMD2.kl.20 is 24 hours after the addition of PBMC after transfection (8,53x10⁴cells/ml), for CD8 T cells was 24 hours after the addition of PBMC aftertransfection (49,4x10⁴ cells/ml). Optimal conditions secretion of IFNγ-positivecells were activated by pUMD2.kl.20 is 24 hours after the addition of PBMC 48hours after transfection (9,86x10⁴ cells/ml), and for the secretion of TNFα-positive cells were activated by pUMD2.kl.20 is 2 hours after the addition ofPBMC 48 hours after transfection (2,1x10⁴ cells/ml). From this study it can beconcluded that the pUMD2.kl.20 immunogenic, Dengue hemorrhagic fever (DHF) is a disease caused by infection with denguevirus (DENV), which is found in Indonesia. There is no specific therapy in thetreatment of DHF. An effort to develop an effective dengue vaccine is needed. Inthis research, analysis of the immunogenicity of the DNA vaccine candidate prMEdengue serotype 2 (pUMD2.kl.20) by analyzing the CD4 T cells, CD8 T cells,IFN-γ and TNF-α in U937 cells and PBMC in vitro, aims to determine theimmune response when the vaccine is injected into the human body. This researchapproach is based on transfection of U937 cells with pUMD2.kl.20 usinglipofectamin. U937 cells acts as APCs which will express the protein prM-EDENV-2 and presenting these proteins through the MHC class I and MHC class IImolecule to the Peripheral Blood Mononuclear Cell (PBMC) of human body.Stages of the work in this study consisted of: (a) culture cell line U937, (b)transfection of U937 cells with pUMD2.kl.20, (c) transfection of U937 cells withplasmid (pUMVC), (d) infection of U937 cells with DENV-2 strains DS.18/09,(e) staining and observation results of staining using a semi-flow cytometri(TALI). pUMD2.kl.20 activate CD4 T cells and CD8 T cells to proliferate. CD8 Tcells concentration higher than the concentration of CD4 T cells and the secretionof INFγ-positive cells concentration higher than the concentration of the secretionof TNFα-positive cells. Optimal condition of CD4 T cells activation bypUMD2.kl.20 is 24 hours after the addition of PBMC after transfection (8,53x10⁴cells/ml), for CD8 T cells was 24 hours after the addition of PBMC aftertransfection (49,4x10⁴ cells/ml). Optimal conditions secretion of IFNγ-positivecells were activated by pUMD2.kl.20 is 24 hours after the addition of PBMC 48hours after transfection (9,86x10⁴ cells/ml), and for the secretion of TNFα-positive cells were activated by pUMD2.kl.20 is 2 hours after the addition ofPBMC 48 hours after transfection (2,1x10⁴ cells/ml). From this study it can beconcluded that the pUMD2.kl.20 immunogenic]"

"Demam Berdarah Dengue (DBD) adalah infeksi yang disebabkan oleh virus dengue (DENV) yang tersebar luas di wilayah tropis dan subtropis di dunia. DENV merupakan virus RNA rantai tunggal yang mengkode tiga protein struktural, tujuh protein non-struktural, dan dua daerah yang tidak ditranslasikan (UTR). Protein non-struktural 1 (NS1) DENV diketahui memiliki peran yang sangat penting dalam patogenesis infeksi DENV dan sebagai pengembangan vaksin dengue yang menjanjikan. Saat ini, pengembangan vaksin baru dengan DNA yang diimunisasikan memberikan perspektif baru karena aman, stabil, dan imunogenik. Pada penelitian sebelumnya, kami telah berhasil mengonstruksi vaksin rekombinan DNA yang mengkode protein NSI dari DENV-2 (pUNS1) dan diekspresikan secara in-vitro. Oleh karena itu, pada penelitian ini dilakukan analisis lebih lanjut untuk melihat kemampuan pUNS1 dalam menginduksi respons imun humoral dengan imunisasi in-vivo. Sebanyak 16 mencit Balb/c yang berumur 4 minggu diimunisasi sebanyak 3 kali dengan 100 μg pUNS1 atau pUMVC4.a dalam interval waktu 1 minggu. Pengambilan sampel darah mencit dilakukan sebelum imunisasi dan dilakukan terminasi 1 minggu setelah imunisasi terakhir. Titer antibodi dari serum masing-masing mencit diukur dengan ELISA in-house. Titer IgG total, antibodi subkelas IgG2a dan IgG2b dari kelompok mencit yang diimunisasi dengan rekombinan pUNS1 menunjukkan perbedaan yang signifikan antara serum pre-imunisasi dengan terminasi. Hal ini membuktikan kemampuan pUNS1 dalam menginduksi respons imun humoral terhadap NS1 DENV-2 secara in-vivo

---

Dengue Hemorrhagic Fever (DHF) is an infectious disease caused by the dengue virus (DENV) which spread widely in tropical and subtropical regions of the world. DENV is a single-positive strand RNA virus which encodes three structural proteins, seven non-structural proteins, and two untranslated regions (UTR). The non-structural protein-1 (NS1) of DENV is known to have important role in dengue pathogenesis also promising to be developed as dengue vaccine. Lately, novel vaccine approach by DNA immunization have given new perspective for a safe, stable, and immunogenic vaccine platform. Previously, we have successfully construct DNA vaccine encoding NS1 protein of DENV2 (pUNS1) which express recombinant NS1 protein in-vitro. Thus, in this current study the ability of pUNS1 to induce humoral immune response will be further analyzed by in-vivo immunization. Sixteen Balb/c mice aged of 4 weeks were immunized 3 times with 100 μg of pUNS1 or pUMVC4.a on 1 week time interval. Blood sampling was carried out just before immunization and termination was done 1 week after last immunization. Titer from individual mice sera against DENV-2 were measure with in-house ELISA. Total IgG titers, subclass IgG2a, and IgG2b antibodies from mice group immunized with recombinant pUNS1 showed a significant difference between pre-immunization and terminated serum. This is proven the ability of pUNS1 to induce humoral immune response against NS1 DENV-2 in-vivo."

"Infeksi virus dengue masih menjadi masalah kesehatan di Indonesia dengan angka kejadian yang cukup besar setiap tahunnya. Virus ini memiliki 3 protein struktural dan 7 protein non struktural. Salah satu dari protein non struktural yaitu non struktural l (NSI) memiliki tingkat imunogenisitms yang cukup tinggi dan dihasilkan di awal infeksi. Protein NSI juga tidak menunjukkan adanya reaksi silang dcngan virus golongan flvivirus lainnya, sehingga menjadi kandidat yang baik untuk digunakan sebagai antigen diagnosis infeksi dengue. Kami mencoba memproduksi protein non-struktural 1 (NSI) rekombinan dari virus dengue serotype-2 yang berasal dari strain DS-3106 pasien DI-IF Jakarta tahun 2006 untuk diiadikan sebagai kandidat antigen. Gen NSI diamplifikasi dengan PCR untuk kemudian diklon ke dalam vektor pGEX-6P-l dan selanjutnya diekspresikan di dalam baketri EZ coli strain BL-21. Hasil analisis SDS-PAGE dan westem blot menunjukkan bahwa protein NSI rekombinan telah berhasil diekspesikan pada kisaran 80 kDa. Protein nekombinan Gst»-NSI telah berhasil dipurifikasi menggunakan Sephadex-G-100 serta kit Purifikasi Bulk Gst dengan kadar 21 ng/ ul.Protein ini juga menunjukkan adanya reaktivims dengan serum pasien dengue. Produksi protein NSI secara nekombinan dapat menjadi altcmatif untuk menycdiakan antigen dalam skala besar dan aman yang dapat digtmakan dalam pengembangan diagnosis infeksi dengue.

---

Dengue virus infection is still the major health problem in Indonesia with high CFR every year. Dengue virus has 3 structural proteins and 7 non structural proteins. It is reported that the non structural l (NSI) protein is immunologic and is produced in the earlier stage of infection.'[`his protein does not show any cross reaction so it can be a good candidate for diagnonic antigen of dengue infection. We are trying to produce a recombinant NSI protein from DS 3106 strain which is isolated hom DHF patient in Jakarta. The NS] gene was amplified with PCR and cloned in pGEX-6P-l systems to be expressed in EZ coli BL2l strain. SDS-PAGE and western blot analysis showed that the recombinant NSI was expressed in 80 kDa range. The recombinant Gst-NS] also had been purified using Sephadex-G-100 and Bulk Gst Purification Kit with the concentration 21 ng/ uL amount and this protein showed reactivity with dengue patient sera. NSI production with recombinant system can be the alternative way to provide antigen safely in large scale to improve dengue diagnostic."

"ABSTRAKLatar Belakang : Penyakit demam dengue dan demam berdarah dengue yang disebabkan oleh virus dengue masih menjadi masalah kesehatan di dunia. Hingga saat ini pengobatan spesifik serta vaksin untuk infeksi dengue belum tersedia, dan berbagai strategi pembuatan vaksin sedang dikembangkan oleh berbagai pihak. Sebagai salah satu negara endemis infeksi dengue, Indonesia juga perlu melakukan pengembangan vaksin dengue dengan menggunakan strain virus yang berasal dari Indonesia. Pada penelitian ini akan dikembangkan kandidat vaksin DNA rekombinan dengan gen insersi Premembran dan Envelope virus dengue tipe 2 sebagai bagian dari pengembangan vaksin dengue tetravalen di Indonesia.Metode : Plasmid DNA rekombinan dirancang mengandung gen premembran dan envelope dari virus dengue tipe 2 isolat Indonesia. Fragmen DNA diinsersi ke dalam vektor plasmid pUMVC4a serta ditransformasi ke dalam sel E.coli DH5-α. Klon plasmid yang didapat dikonfirmasi dengan metode PCR, enzim restriksi dan sekuensing. Ekspresi protein dari plasmid diuji melalui metode transfeksi pada sel Vero. Selanjutnya plasmid disuntikkan pada mencit jenis Balb/C sebanyak 3 kali dengan interval 3 minggu pada daerah intramuskular. Penyuntikan menggunakan 2 metode : suntikan intramuskular dengan jarum (IM) dan suntikan dengan menggunakan alat needle-free injector (NFI) dengan menggunakan 2 macam dosis plasmid, yaitu 25 μg dan 100 μg DNA. Pemeriksaan antibodi dilakukan dengan metode ELISA dan PRNT. Setelah fase imunisasi selesai, dilakukan uji tantang dengan menyuntikkan 2,5 x 105 PFU/ml DENV-2 secara intraperitoneal pada beberapa kelompok mencit untuk melihat pembentukan sel B memori. Data antibodi yang diperoleh dianalisis secara deskriptif dan analitik.Hasil : Plasmid rekombinan pUMD2 telah berhasil diperoleh. Transfeksi pada sel Vero menunjukkan adanya ekspresi protein intra dan ekstraselular melalui pemeriksaan imunostaining dan ELISA. Melalui pemeriksaan ELISA, antibodi terdeteksi hanya pada kelompok penyuntikan NFI (p<0,005). Titer antibodi tertinggi dijumpai pada kelompok penyuntikan dengan NFI dosis 100 μg , kemudian NFI 25 μg dengan perbedaan yang tidak bermakna (p>0,005) antara kedua kelompok tersebut. Melalui PRNT 70% ditemukan bahwa antibodi netralisasi terhadap DENV-2 terbentuk pada mencit yang diberi imunisasi dengan metode NFI, sedangkan pada kelompok IM titernya tidak terdeteksi (<1/10). Titer antibodi terbaik diperoleh pada kelompok penyuntikan NFI dosis 100 ug yaitu 1/80-1/160. Titer hari ke-4 dan 8 setelah penyuntikan 2,5 x 105 PFU/ml virus pada kelompok yang diimunisasi secara IM dan NFI mengalami peningkatan. Sebaliknya, pada kelompok yang tidak diberi virus tidak terdapat peningkatan titer netralisasi. Hal ini menunjukkan adanya pembentukan sel B memori dari imunisasi yang diberikan.Kesimpulan : Pembuatan plasmid rekombinan dengan gen insersi pre-M dan E DENV2 strain DS18/09 telah berhasil dilakukan. Terdapat respon antibodi netralisasi dan anamnestik dari mencit yang diberi imunisasi secara NFI, namun imunisasi secara IM hanya menunjukkan respon antibodi anamnestik dari sel memori. Plasmid DNA rekombinan ini memiliki potensi sebagai kandidat vaksin DNA terhadap virus dengue tipe 2. Perlu dilakukan penelitian selanjutnya berupa rancangan vaksin tetravalen dalam upaya pengembangan vaksin dengue secara menyeluruh.

---

ABSTRACTIntroduction : Dengue fever and dengue haemorrhagic fever caused by dengue virus is still a major health problem. There are four types of Dengue virus which antigenically distinguished : DEN-1, DEN-2, DEN-3, DEN-4. Currently, no specific treatment for Dengue infection and no vaccine are available, and various strategies have been used to develop dengue vaccine. Indonesia as one of dengue-endemic country has to attempt dengue vaccine development particularly using Indonesian virus strain. In this study, recombinant DNA vaccine candidate using DENV-2 pre-membrane and envelope genes was constructed as a part of dengue tetravalent vaccine development in Indonesia.Methods : The recombinant plasmid consisting pre-membrane and envelope genes from DENV-2 Indonsia isolate was constructed. DNA fragment were inserted to pUMVC4a plasmid vector and then transformed to E. Coli DH5-α. The construction was confirmed using PCR, restriction enzyme and sequencing. Protein expressions of preM and E were determined by transfection into Vero cells. Group of Balb/C mice were injected with amount of plasmid via intra muscular route. The injection was conducted using 2 delivery methods : conventional syringe-needle (IM) and needle-free injector (NFI) device. Doses of plasmid that being compared are 25 μg and 100 μg. Mice were immunized with plasmid 3 times with 3 weeks interval. Antibody titre were determined by ELISA and PRNT. After immunization phase, part group of mice challanged with 2,5 x 105 PFU/ml DENV-2 intra peritoneally to confirm wether immunization induced memory cells. Antibody data were interpretated by descriptive and analytic methodsResults : The recombinant plasmid pUMD2 has been constructed. Confirmation of gene secuence showed no mutation at the clone. Vero cells-81 transfected with pUMD2 expressed prM and E as determined by immunofluorescence staining as intracellular protein and by ELISA to detect extracellular protein. In ELISA results, antibody was detected only in NFI group (p<0,005). Highest antibody titre was found in NFI group with dose 100 μg followed by dose 25 μg. However, antibody titre by ELISA between NFI group dose 100 μg and 25 μg were not statistically significant (p>0,005). Neutralizing antibody by PRNT 70% showed concordant result compared to ELISA. Neutralizing titre to DENV-2 was developed in NFI group, but it was not detectable in IM group of mice (<1/10). The highest titre of neutralization achieved by 100 μg, NFI group whose titer 1/80-1/160. Immunized mice in all groups raised greater neutralizing antibody titers on days 4 and 8 after challange with 2,5 x 105 PFU/ml of DS 18/09 of dengue type 2 virus. Compared to immunized mice that were not challanged which developed no increasing neutralizing titre, it indicated that immunization could produced memory B cell responses.Conclusions : Recombinant plasmid as a candidate for dengue DNA vaccine has been constructed. The plasmid expressed premembrane and envelope proteins in Vero cells. Immunogenicity test from the plasmid DNA demonstrated neutralizing antibody responses and anamnestic responses in mice which immunized only by NFI method. IM injection method only showed anamnestic antibody responses. Overall, this DNA plasmid has a potency to be used as a candidate for DNA vacine against dengue virus type-2. Study for designing tetravalent vaccine model is necessary as a part in vaccine dengue development."

"Infeksi DENV masih menjadi masalah kesehatan masyarakat di Indonesia karena dapat menyebabkan penyakit berat dan bahkan mungkin berakibat fatal. Pengembangan vaksin rekombinan dengan antigen yang mampu dengan efektif menginduksi respon imun perlu untuk dikembangkan. Kesesuaian genotipe yang digunakan di vaksin dan genotipe yang beredar di suatu wilayah berimplikasi terhadap keberhasilan pengembangan vaksin. Plasmid rekombinan yang dirancang berdasarkan gen prM-E DENV-2 strain 151 diekspresikan di Pichia pastoris strain X-33. Telah dilakukan optimasi ekspresi dan antigenisitas protein rekombinan prM-E. Diperoleh 4 koloni P. pastoris rekombinan dengan fenotipe Mut . Hasil SDS-PAGE dan Western blot menunjukkan protein telah berhasil diekspresikan pada ukuran 50 kDa. Kondisi ekspresi optimum protein rekombinan prM-E DENV-2 yaitu pada konsentrasi metanol 1 dengan waktu inkubasi 48 jam. Protein rekombinan prM-E DENV-2 dikenali oleh antibodi anti- prM-E DENV-2 dan bereaksi silang dengan antibodi anti-prM-E DENV-1, DENV-3, serta DENV-4. Protein rekombinan prM-E DENV-2 yang diperoleh dapat digunakan sebagai antigen dalam pengembangan vaksin protein rekombinan dengue strain Indonesia.

---

DENV infection is still a public health problem in Indonesia because it can cause severe illness and may even be fatal. Development of recombinant vaccine with antigens capable of effectively inducing an immune response needs to be developed. The suitability of genotypes used in vaccines and genotypes circulating in a region has implications for the successful development of vaccines. Construction of a recombinant plasmid based on prM E gene of DENV 2 strain 151 was used for expression in Pichia pastoris strain X 33. Optimization and antigenicity of DENV 2 prM E recombinant protein were tested. Four Mut phenotypes were generated. SDS PAGE and Western blot analysis showed that the protein was expressed with a molecular weight of 50 kDa. Optimal protein expression level occurred at concentration of 1 methanol with 48 hours incubation time. DENV 2 prM E recombinant protein was recognized by anti prM E DENV 2 and also showed cross reaction with anti prM E DENV 1, DENV 3, and DENV 4 antibodies. Thus, the DENV 2 prM E recombinant protein can be used as an antigen in the development of the recombinant protein vaccine of the dengue strains of Indonesia. "

"Infeksi virus Dengue (DENV) masih menjadi masalah kesehatan dunia termasuk Indonesia, mengamcam lebih dari 150 ribu jiwa setiap tahunnya. Meski berbagai usaha preventif konvensional telah dilakukan, angka keparahan tetap tidak jauh berkurang. Karena itu, vaksin dikembangkan sebagai usaha preventif yang efektif sekaligus efisien. Sayangnya, jumlah studi filogenetik yang mendukung pengembangan vaksin saat ini masih terbatas. Untuk itu, penelitian ini dilakukan dengan menganalisis sekuens nukleotida dan asam amino protein Non Struktural-1 (NS-1) pada bagian epitope. Analisis dilakukan dari data yang dikumpulkan melalui GenBank dan Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia, 29 sekuens diolah menggunakan program Genetyx 5.1. Hasil analisis menunjukkan persebaran filogenetik berdasarkan nukleotida NS-1 strain Indonesia yang berada pada Genotipe I dan IV dan tidak berbeda dengan filogenetik berdasarkan gen envelope. Sedangkan, hasil homologi asam amino menunjukkan substitusi terjadi pada beberapa situs epitope NS-1 yang sebelumnya dianggap lestari. Hasil ini menunjukkan bahwa, analisis NS-1 dapat digunakan sebagai dasar pengembangan vaksin dengue.

---

Until to date, dengue virus (DENV) infection is still a major global health problem including Indonesia, putting over 150 thousands people at risk every year. Despite various conventional preventive efforts conducted, number of people with severe dengue is not reduce significantly. Vaccine is than developed in a hope to make a more effective and efficient way of dengue prevention. But, only a limited number of phylogenetic studies have been conducted to support the vaccine development. This phylogenetic studies of dengue virus (DENV) is conducted in order to support the basis for development of protective dengue vaccine. This study analyze nucleotides and amino acids sequence of Non Structural-1 (NS-1) protein and emphasizing at epitope sites. By using Genetyx 5.1, 29 samples that have been collected from Laboratory of Microbiology Faculty of Medicine Universitas Indonesia and GenBank were analized. Phylogenetic tree analysis using NS-1 nucleotides showing that isolates from Indonesia is potitioned within genotipe I and IV, insignifically different with phylogenetic tree analysis using envelope nucleotides. While, amino acid homology analysis showing subtitution between NS1 epitope sites that considered being conserved at the previous studies. This results shows that, NS-1 analysis can be used as a basis of vaccine development."

"Infeksi yang disebabkan oleh virus dengue (DENV) menimbulkan spektrum luas penyakit dari sindrom virus ringan, demam dengue klasik dan penyakit perdarahan berat yaitu demam berdarah dengue (DBD) hingga Dengue Shock Syndrom (DSS). Antibodi terhadap protein struktural E dari serotipe DENV yang heterolog pada infeksi primer dan sekunder tidak dapat menetralkan virus, sehingga walaupun kompleks antibodi-virus difagositosis oleh monosit, DENV tetap dapat bereplikasi di dalam monosit. Kondisi meningkatnya infeksi virus pada sel target diperantarai antibodi ini dikenali sebagai antibody-dependent enhancement (ADE). Protein NS3 merupakan protein terbesar kedua yang dikode oleh genom DENV dan sekuens asam amino primernya merupakan yang paling lestari diantara serotipe DENV yang berguna menghindari ADE. Protein NS3 ditemukan menginduksi respon antibodi dan respon sel T CD4+ dan CD8+, kebanyakan sel T tersebut bereaksi silang antar serotipe. Dilakukan analisis pada epitop sel T dan sel B protein NS3 DENV4 081 yang selanjutnya dilakukan pengklonaan dan ekspresi gen NS3 DENV4 081. Ditemukan posisi epitop sel B 537-544 NS3 DENV4 081 identik dan lestari dengan 124 strain DENV4 di dunia dan dengan keempat serotipe strain Indonesia. Gen NS3 DENV4 081 berhasil diamplifikasi dengan teknik PCR dan berhasil diinsersikan kedalam vektor pQE80L dengan orientasi yang benar. Plasmid rekombinan yang mengandung gen NS3 DENV4 081 ditransformasikan ke dalam E. coli BL21 dan diekspresikan dengan induksi IPTG. Hasil ekspresi protein NS3 DENV4 081 yang ditunjukkan dengan terlihatnya dot yang berwarna lebih pekat pada Dot Blot yang dideteksi dengan detektor anti-His merupakan protein rekombinan NS3 DENV4 081. Hasil Western Blot menunjukkan ekspresi protein rekombinan NS3 yang rendah, sehingga masih perlu penelitian lebih lanjut untuk mengoptimalkan ekspresi protein rekombinan NS3 pada vektor pQE80L.

---

Infections caused by dengue virus (DENV) cause a broad spectrum of disease from mild viral syndrome, classic dengue fever to severe hemorrhagic diseases which are dengue hemorrhagic fever (DHF) and Dengue Shock Syndrome (DSS). Antibodies against E protein of heterologous DENV serotypes in primary and secondary infections can not neutralize the virus, although the antibody-virus complexes were phagocytes by monocytes, DENV still replicate inside monocytes. A condition increasing antibody-mediated viral infection on target cell was identified as antibody-dependent enhancement (ADE). NS3 protein is the second largest protein encoded by the genome of DENV and the primary amino acid sequence is the most conserved among DENV serotypes. NS3 protein was found to induce antibody, CD4+ and CD 8+ T cell responses, most of the T cells were cross-reactive between serotypes. Analysis was performed on the T and B cell epitope of NS3 DENV4 081 protein then continue with gene cloning and expression of NS3 DENV4 081. Position of B cell epitope 537-544 NS3 DENV4 081 protein was found identical and conserved to NS3 protein of 124 DENV4 strains around the world and all four serotypes of Indonesia strain. NS3 DENV4 081 gene was successfully amplified by PCR and successfully inserted into the vector pQE80L with the correct orientation. Recombinant plasmid containing NS3 DENV4 081 gene was transformed into E. coli BL21 and expressed by IPTG induction. Results of NS3 DENV4 081 protein expression was indicated by the colored dot produced on Dot Blot detected with anti-His detector. Western Blot result show low NS3 recombinant protein expression, so further research is needed to optimize the NS3 expression in vector pQE80L."

"Demam Dengue (DD) dan Demam Berdarah Dengue (DBD) adalah penyakit yang tersebar luas. Penelitian ini dilakukan untuk mengembangkan kandidat vaksin dengue nasional berbasis protein sub unit prM/E DEN-4. Protein prM/E adalah kompleks unik yang berperan penting dalam perakitan virus dan modulasi fusi. Penelitian telah dilakukan dengan metode Gateway cloning system untuk menklon gen prM/E dalam plasmid cloning pDONR221 kemudian dilakukan subkloning dan dipindahkan gen prM/E ke dalam plasmid eksperesi pET-55-DEST. Ekspresi protein prM/E dilakukan di dalam E.coli BL21 (DE3) dengan induksi Isoprophyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG). Pendeteksian poliprotein Gag hasil ekspresi dilakukan dengan metode Sodium Dodecyl Sulphate Polyacrilamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE). Setelah protein prM/E berhasil dideteksi kemudian protein prM/E dipurifikasi dengan menggunakan metode immobilized metal affinity chromatography (IMAC) di bawah kondisi denaturasi. Hasil penelitian yaitu protein prM/E dapat diekspresikan dalam E.coli BL21 (DE3) dengan berat molekul ~75 kDa.

---

Dengue Fever is an infectious disease caused by one of the four serotypes of dengue virus (DENV). Until now, no licensed vaccines or antivirus is available commercially. Because of that, this research was aimed to develop candidate vaccine dengue based on protein subunit pre-membrane and Envelope (prM/E). Protein prM/E is a unique complex which has important role in virus assemblyand host cell entry. The recombinant protein development was done using Gateway cloning system. This was used to clone the prM/E gene into pDONR221 plasmid. The cloned gene was then transferred into pET-55-DEST expression plasmid. Expression of protein prM/E was perfomed in E. coli BL21 (DE3) with inducer Isoprophyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG). Sodium Dodecyl Sulphate Polyacrilamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) method was used to detect the expressed prM/E protein. Upon detection of prM/E protein with SDS-PAGE, the recombinant protein was purified by using immobilized metal affinity chromatography (IMAC) method under denature condition. Using these methods, the prM/E protein was successfully expressed in E.coli BL21 (DE3) with a molecular weight ~75 kDa."

"Latar belakang: Infeksi virus dengue masih menjadi masalah di negara tropis seperti Indonesia. Infeksi virus dengue menyebabkan mortalitas dan morbiditas yang tinggi. Belum ada obat ataupun vaksin yang telah disetujui penggunaannya dan tersedia di dunia untuk penyakit infeksi dengue. Pencegahan infeksi dengue masih terbatas pada pengendalian vektor nyamuk Aedes aegypti. Keempat serotipe virus dengue beredar di Indonesia. Dua genotipe dari virus dengue tipe 1 (DENV-1) yaitu genotipe I dan IV lebih dominan bersirkulasi di Indonesia. Pada tahun 2012, kami mengembangkan kandidat vaksin DNA DENV-1 pUMVC RDS 59/09. Tujuan penelitian ini untuk mengetahui kadar antibodi anti-membran dan envelop DENV-1 yang dihasilkan mencit ddY setelah imunisasi sebanyak tiga kali dengan pUMVC RDS 59/09 dan untuk mengetahui kemampuan antibodi tersebut dalam menetralkan beberapa genotipe DENV-1 yang diisolasi di Indonesia. Metode: Penelitian eksperimental ini dimulai dari perbanyakan pUMVC RDS 59/09 di sel E.coli untuk mendapatkan konsentrasi yang tinggi. Imunisasi dilakukan pada 12 mencit strain ddY dengan pUMVC RDS 59/09 25 μg/100 μl menggunakan needle-free injector, sebanyak tiga kali dengan interval waktu 3 minggu. Sebanyak 12 mencit disediakan sebagai kontrol yang tidak diimunisasi. Antibodi anti-membran dan envelop DENV-1 pada masing-masing serum mencit diperiksa dengan ELISA dan dibaca pada panjang gelombang 450 nm. Berikutnya, pooled serum mencit pasca imunisasi ke 3, digunakan untuk netralisasi 13 isolat DENV-1 dengan metode focus reduction neutralization test (FRNT). Fokus yang didapatkan dari FRNT diwarnai dengan tehnik imunoperoksidase dan dihitung secara manual. Hasil: Rerata nilai OD ELISA antibodi anti-membran dan envelop DENV-1 dari serum mencit kelompok imunisasi yang diambil sebelum imunisasi, pasca imunisasi 1, pasca imunisasi 2 dan pasca imunisasi 3 adalah 0,329;0,843;1,524 dan 1,598, secara berurutan. Terdapat peningkatan nilai OD ELISA antibodi anti-membran dan envelop DENV-1 dari pooled serum mencit kelompok imunisasi pasca imunisasi pertama, kedua dan ketiga dibandingkan dengan baseline. Titer FRNT antibodi anti-membran dan envelop DENV-1 dari pooled serum mencit pasca imunisasi 3 dan pooled serum mencit kontrol terhadap strain DV-1 RDS 59/09 adalah 1/320 dan < 1/10. Titer FRNT 13 isolat DENV-1 oleh antibodi anti-membran dan envelop DENV-1 dari pooled serum mencit pasca imunisasi 3 berkisar dari 1/320 sampai lebih dari 1/1280. Kesimpulan: Variasi genotipe DENV-1 tidak menyebabkan perbedaan titer antibodi netralisasi yang bermakna (p = 0,222), sehingga dapat diuraikan bahwa antibodi anti-membran dan envelop DENV-1 dapat menetralkan 13 isolat DENV-1 Indonesia yang diuji.

---

Introduction: Dengue virus infection is still a burden in tropical country such as Indonesia. Dengue virus infection causes high mortality and morbidity. No drugs or vaccines are approved and available in the world for this disease. Dengue prevention is still limited to vector control. Four dengue serotypes are circulated in Indonesia. Two genotypes of Dengue virus type 1 (DENV-1), namely genotypes I and IV are found predominantly in Indonesia. Previously in 2012, we constructed pUMVC RDS 59/09, the DENV-1 DNA vaccine candidate. The objective of this study is to assess antibody level produced in ddY strain mice after three times immunization with pUMVC RDS 59/09 and to assess the antibody ability to neutralize genotypes of DENV-1 isolated in Indonesia.

Methods: This experimental study was started with propagation of pUMVC RDS 59/09 in E. coli cells to produce high concentration of the DNA. Immunization was carried out with 25 μg/ 100 μl pUMVC RDS 59/09 by needle-free injector, three times in 3 weeks interval. Twelve mice were provided for control without immunization. Anti-DENV-1 membrane and envelope antibody of individual sera were examined by ELISA and absorbance value was measured by ELISA reader in 450 nm wave length. Further, pooled sera of 3rd immunization were used to neutralize 13 DENV-1 isolates by focus reduction neutralization test (FRNT) method. The focus obtained in FRNT was stained by immune-peroxides technique and counted manually.

Results: ELISA OD value mean of anti-DENV-1 membrane and envelope antibody in individual ddY mice sera of immunized group before immunization, post first immunization, after second immunization and post third immunization were 0.329; 0.843; 1.524 and 1.598, respectively. An increase in ELISA OD value of anti-DENV-1 membrane and envelope antibody in ddY mice pooled sera of immunized group after first, second and third immunization compared to baseline was observed. FRNT titre of anti-DENV-1 membrane and envelope antibody from third immunization pooled sera compared to control mice pooled sera in RDS 59/09 isolate neutralization was 1/320 compared to < 1/10. Neutralization titre of 13 DENV-1 isolates by anti-DENV-1 membrane and envelope antibody from third immunization pooled sera ranged from 1/320 to more than 1/1280.

Conclussions: DENV-1 genotype variation did not lead to significant neutralization antibody titre difference (p = 0,222), so it can be explained that anti-DENV-1 membrane and envelope antibody was able to neutralize 13 strains of Indonesia DENV-1 isolates examined."