Hasil Pencarian  ::  Simpan CSV :: Kembali

"ABSTRAKLatar Belakang : Penyakit demam dengue dan demam berdarah dengue yang disebabkan oleh virus dengue masih menjadi masalah kesehatan di dunia. Hingga saat ini pengobatan spesifik serta vaksin untuk infeksi dengue belum tersedia, dan berbagai strategi pembuatan vaksin sedang dikembangkan oleh berbagai pihak. Sebagai salah satu negara endemis infeksi dengue, Indonesia juga perlu melakukan pengembangan vaksin dengue dengan menggunakan strain virus yang berasal dari Indonesia. Pada penelitian ini akan dikembangkan kandidat vaksin DNA rekombinan dengan gen insersi Premembran dan Envelope virus dengue tipe 2 sebagai bagian dari pengembangan vaksin dengue tetravalen di Indonesia.Metode : Plasmid DNA rekombinan dirancang mengandung gen premembran dan envelope dari virus dengue tipe 2 isolat Indonesia. Fragmen DNA diinsersi ke dalam vektor plasmid pUMVC4a serta ditransformasi ke dalam sel E.coli DH5-α. Klon plasmid yang didapat dikonfirmasi dengan metode PCR, enzim restriksi dan sekuensing. Ekspresi protein dari plasmid diuji melalui metode transfeksi pada sel Vero. Selanjutnya plasmid disuntikkan pada mencit jenis Balb/C sebanyak 3 kali dengan interval 3 minggu pada daerah intramuskular. Penyuntikan menggunakan 2 metode : suntikan intramuskular dengan jarum (IM) dan suntikan dengan menggunakan alat needle-free injector (NFI) dengan menggunakan 2 macam dosis plasmid, yaitu 25 μg dan 100 μg DNA. Pemeriksaan antibodi dilakukan dengan metode ELISA dan PRNT. Setelah fase imunisasi selesai, dilakukan uji tantang dengan menyuntikkan 2,5 x 105 PFU/ml DENV-2 secara intraperitoneal pada beberapa kelompok mencit untuk melihat pembentukan sel B memori. Data antibodi yang diperoleh dianalisis secara deskriptif dan analitik.Hasil : Plasmid rekombinan pUMD2 telah berhasil diperoleh. Transfeksi pada sel Vero menunjukkan adanya ekspresi protein intra dan ekstraselular melalui pemeriksaan imunostaining dan ELISA. Melalui pemeriksaan ELISA, antibodi terdeteksi hanya pada kelompok penyuntikan NFI (p<0,005). Titer antibodi tertinggi dijumpai pada kelompok penyuntikan dengan NFI dosis 100 μg , kemudian NFI 25 μg dengan perbedaan yang tidak bermakna (p>0,005) antara kedua kelompok tersebut. Melalui PRNT 70% ditemukan bahwa antibodi netralisasi terhadap DENV-2 terbentuk pada mencit yang diberi imunisasi dengan metode NFI, sedangkan pada kelompok IM titernya tidak terdeteksi (<1/10). Titer antibodi terbaik diperoleh pada kelompok penyuntikan NFI dosis 100 ug yaitu 1/80-1/160. Titer hari ke-4 dan 8 setelah penyuntikan 2,5 x 105 PFU/ml virus pada kelompok yang diimunisasi secara IM dan NFI mengalami peningkatan. Sebaliknya, pada kelompok yang tidak diberi virus tidak terdapat peningkatan titer netralisasi. Hal ini menunjukkan adanya pembentukan sel B memori dari imunisasi yang diberikan.Kesimpulan : Pembuatan plasmid rekombinan dengan gen insersi pre-M dan E DENV2 strain DS18/09 telah berhasil dilakukan. Terdapat respon antibodi netralisasi dan anamnestik dari mencit yang diberi imunisasi secara NFI, namun imunisasi secara IM hanya menunjukkan respon antibodi anamnestik dari sel memori. Plasmid DNA rekombinan ini memiliki potensi sebagai kandidat vaksin DNA terhadap virus dengue tipe 2. Perlu dilakukan penelitian selanjutnya berupa rancangan vaksin tetravalen dalam upaya pengembangan vaksin dengue secara menyeluruh.

---

ABSTRACTIntroduction : Dengue fever and dengue haemorrhagic fever caused by dengue virus is still a major health problem. There are four types of Dengue virus which antigenically distinguished : DEN-1, DEN-2, DEN-3, DEN-4. Currently, no specific treatment for Dengue infection and no vaccine are available, and various strategies have been used to develop dengue vaccine. Indonesia as one of dengue-endemic country has to attempt dengue vaccine development particularly using Indonesian virus strain. In this study, recombinant DNA vaccine candidate using DENV-2 pre-membrane and envelope genes was constructed as a part of dengue tetravalent vaccine development in Indonesia.Methods : The recombinant plasmid consisting pre-membrane and envelope genes from DENV-2 Indonsia isolate was constructed. DNA fragment were inserted to pUMVC4a plasmid vector and then transformed to E. Coli DH5-α. The construction was confirmed using PCR, restriction enzyme and sequencing. Protein expressions of preM and E were determined by transfection into Vero cells. Group of Balb/C mice were injected with amount of plasmid via intra muscular route. The injection was conducted using 2 delivery methods : conventional syringe-needle (IM) and needle-free injector (NFI) device. Doses of plasmid that being compared are 25 μg and 100 μg. Mice were immunized with plasmid 3 times with 3 weeks interval. Antibody titre were determined by ELISA and PRNT. After immunization phase, part group of mice challanged with 2,5 x 105 PFU/ml DENV-2 intra peritoneally to confirm wether immunization induced memory cells. Antibody data were interpretated by descriptive and analytic methodsResults : The recombinant plasmid pUMD2 has been constructed. Confirmation of gene secuence showed no mutation at the clone. Vero cells-81 transfected with pUMD2 expressed prM and E as determined by immunofluorescence staining as intracellular protein and by ELISA to detect extracellular protein. In ELISA results, antibody was detected only in NFI group (p<0,005). Highest antibody titre was found in NFI group with dose 100 μg followed by dose 25 μg. However, antibody titre by ELISA between NFI group dose 100 μg and 25 μg were not statistically significant (p>0,005). Neutralizing antibody by PRNT 70% showed concordant result compared to ELISA. Neutralizing titre to DENV-2 was developed in NFI group, but it was not detectable in IM group of mice (<1/10). The highest titre of neutralization achieved by 100 μg, NFI group whose titer 1/80-1/160. Immunized mice in all groups raised greater neutralizing antibody titers on days 4 and 8 after challange with 2,5 x 105 PFU/ml of DS 18/09 of dengue type 2 virus. Compared to immunized mice that were not challanged which developed no increasing neutralizing titre, it indicated that immunization could produced memory B cell responses.Conclusions : Recombinant plasmid as a candidate for dengue DNA vaccine has been constructed. The plasmid expressed premembrane and envelope proteins in Vero cells. Immunogenicity test from the plasmid DNA demonstrated neutralizing antibody responses and anamnestic responses in mice which immunized only by NFI method. IM injection method only showed anamnestic antibody responses. Overall, this DNA plasmid has a potency to be used as a candidate for DNA vacine against dengue virus type-2. Study for designing tetravalent vaccine model is necessary as a part in vaccine dengue development."

"Demam Berdarah Dengue (DBD) adalah infeksi yang disebabkan oleh virus dengue (DENV) yang tersebar luas di wilayah tropis dan subtropis di dunia. DENV merupakan virus RNA rantai tunggal yang mengkode tiga protein struktural, tujuh protein non-struktural, dan dua daerah yang tidak ditranslasikan (UTR). Protein non-struktural 1 (NS1) DENV diketahui memiliki peran yang sangat penting dalam patogenesis infeksi DENV dan sebagai pengembangan vaksin dengue yang menjanjikan. Saat ini, pengembangan vaksin baru dengan DNA yang diimunisasikan memberikan perspektif baru karena aman, stabil, dan imunogenik. Pada penelitian sebelumnya, kami telah berhasil mengonstruksi vaksin rekombinan DNA yang mengkode protein NSI dari DENV-2 (pUNS1) dan diekspresikan secara in-vitro. Oleh karena itu, pada penelitian ini dilakukan analisis lebih lanjut untuk melihat kemampuan pUNS1 dalam menginduksi respons imun humoral dengan imunisasi in-vivo. Sebanyak 16 mencit Balb/c yang berumur 4 minggu diimunisasi sebanyak 3 kali dengan 100 μg pUNS1 atau pUMVC4.a dalam interval waktu 1 minggu. Pengambilan sampel darah mencit dilakukan sebelum imunisasi dan dilakukan terminasi 1 minggu setelah imunisasi terakhir. Titer antibodi dari serum masing-masing mencit diukur dengan ELISA in-house. Titer IgG total, antibodi subkelas IgG2a dan IgG2b dari kelompok mencit yang diimunisasi dengan rekombinan pUNS1 menunjukkan perbedaan yang signifikan antara serum pre-imunisasi dengan terminasi. Hal ini membuktikan kemampuan pUNS1 dalam menginduksi respons imun humoral terhadap NS1 DENV-2 secara in-vivo

---

Dengue Hemorrhagic Fever (DHF) is an infectious disease caused by the dengue virus (DENV) which spread widely in tropical and subtropical regions of the world. DENV is a single-positive strand RNA virus which encodes three structural proteins, seven non-structural proteins, and two untranslated regions (UTR). The non-structural protein-1 (NS1) of DENV is known to have important role in dengue pathogenesis also promising to be developed as dengue vaccine. Lately, novel vaccine approach by DNA immunization have given new perspective for a safe, stable, and immunogenic vaccine platform. Previously, we have successfully construct DNA vaccine encoding NS1 protein of DENV2 (pUNS1) which express recombinant NS1 protein in-vitro. Thus, in this current study the ability of pUNS1 to induce humoral immune response will be further analyzed by in-vivo immunization. Sixteen Balb/c mice aged of 4 weeks were immunized 3 times with 100 μg of pUNS1 or pUMVC4.a on 1 week time interval. Blood sampling was carried out just before immunization and termination was done 1 week after last immunization. Titer from individual mice sera against DENV-2 were measure with in-house ELISA. Total IgG titers, subclass IgG2a, and IgG2b antibodies from mice group immunized with recombinant pUNS1 showed a significant difference between pre-immunization and terminated serum. This is proven the ability of pUNS1 to induce humoral immune response against NS1 DENV-2 in-vivo."

"Infeksi DENV masih menjadi masalah kesehatan masyarakat di Indonesia karena dapat menyebabkan penyakit berat dan bahkan mungkin berakibat fatal. Pengembangan vaksin rekombinan dengan antigen yang mampu dengan efektif menginduksi respon imun perlu untuk dikembangkan. Kesesuaian genotipe yang digunakan di vaksin dan genotipe yang beredar di suatu wilayah berimplikasi terhadap keberhasilan pengembangan vaksin. Plasmid rekombinan yang dirancang berdasarkan gen prM-E DENV-2 strain 151 diekspresikan di Pichia pastoris strain X-33. Telah dilakukan optimasi ekspresi dan antigenisitas protein rekombinan prM-E. Diperoleh 4 koloni P. pastoris rekombinan dengan fenotipe Mut . Hasil SDS-PAGE dan Western blot menunjukkan protein telah berhasil diekspresikan pada ukuran 50 kDa. Kondisi ekspresi optimum protein rekombinan prM-E DENV-2 yaitu pada konsentrasi metanol 1 dengan waktu inkubasi 48 jam. Protein rekombinan prM-E DENV-2 dikenali oleh antibodi anti- prM-E DENV-2 dan bereaksi silang dengan antibodi anti-prM-E DENV-1, DENV-3, serta DENV-4. Protein rekombinan prM-E DENV-2 yang diperoleh dapat digunakan sebagai antigen dalam pengembangan vaksin protein rekombinan dengue strain Indonesia.

---

DENV infection is still a public health problem in Indonesia because it can cause severe illness and may even be fatal. Development of recombinant vaccine with antigens capable of effectively inducing an immune response needs to be developed. The suitability of genotypes used in vaccines and genotypes circulating in a region has implications for the successful development of vaccines. Construction of a recombinant plasmid based on prM E gene of DENV 2 strain 151 was used for expression in Pichia pastoris strain X 33. Optimization and antigenicity of DENV 2 prM E recombinant protein were tested. Four Mut phenotypes were generated. SDS PAGE and Western blot analysis showed that the protein was expressed with a molecular weight of 50 kDa. Optimal protein expression level occurred at concentration of 1 methanol with 48 hours incubation time. DENV 2 prM E recombinant protein was recognized by anti prM E DENV 2 and also showed cross reaction with anti prM E DENV 1, DENV 3, and DENV 4 antibodies. Thus, the DENV 2 prM E recombinant protein can be used as an antigen in the development of the recombinant protein vaccine of the dengue strains of Indonesia. "

"ABSTRAKInfeksi yang disebabkan oleh virus dengue telah banyak dilaporkan di negara tropis dan subtropis. Virus dengue terdiri dari 4 serotipe yaitu dengue 1-4. Hingga saat ini belum tersedia vaksin yang berlisensi untuk mencegah terjadinya infeksi dengue. Pada penelitian ini dikonstruksi vaksin DNA yang mengkode gen prM-E dan prM-E-NS1del virus dengue 2 strain Indonesia yang akan dijadikan sebagai kandidat vaksin dengue. Hasil penelitian berhasil mendapatkan 9 plasmid rekombinan pUMDE2 yang membawa gen sisipan prM-E dan telah dikonfirmasi dengan melakukan PCR koloni dan restriksi plasmid. Dari hasil sekuensing plasmid pUMDE2 koloni no. 11 ditemukan 19 mutasi asam amino pada gen prM-E, sepuluh mutasi pada gen prM dan sembilan mutasi pada gen E. Mutasi protein prM N29D dan N52K serta protein E V164I dan S390N terletak pada daerah epitop pengenalan sel B. Transfeksi plasmid pUMDE2 dilakukan pada sel Chinese Hamster Ovary (CHO)-K1 dan menunjukkan adanya ekspresi protein prM-E rekombinan berdasarkan uji imunostaining dan ELISA. Hasil ELISA menunjukkan bahwa protein ditemukan pada sel yang ditransfeksi. Sedangkan, plasmid rekombinan yang membawa gen prM-E-NS1del tidak berhasil dikonstruksi. Plasmid pUMDE2 dapat dikembangkan menjadi kandidat vaksin DNA.

---

ABSTRACT

Infection by dengue virus were reported in tropical and subtropical area. Dengue virus (DENV) consist of 4 serotype, DENV-1 to DENV-4. There is no licensed vaccine available for dengue infection. In this research, we construct DNA vaccine encode prM-E and prM-E-NS1del genes of dengue virus serotype 2 for vaccine development. Nine recombinant plasmids that encode prM-E genes (pUMDE2), were successfully obtained. Recombinant plasmids were confirmed by PCR colony and restriction enzyme analysis. Colony of pUMDE2 no. 11 was sequenced and total 19 amino acid mutations were founds, 10 mutations in prM and 9 mutations in E protein. prM mutations N29D and N52K, E mutations of V164I and S390N were found in B cell epitopes. Transfection pUMDE2 plasmid was done to Chineese Hamster Ovary (CHO)-K1 and showed that recombinant protein prM-E was successfully expressed by immunostaining assay and ELISA. Results showed that the protein was mainly found in cell fraction. However, recombinant plasmid that encode prM-E-NS1del were failed to be constructed. pUMDE2 could be developed for vaccine candidate."

"[ABSTRAKDemam berdarah dengue (DBD) merupakan penyakit yang disebabkan karenainfeksi virus dengue (DENV), yang banyak ditemukan di Indonesia. Belum adaterapi yang spesifik dalam pengobatan DBD. Upaya pengembangan vaksindengue yang efektif sangat diperlukan. Pada penelitian ini dilakukan analisaimunogenisitas kandidat vaksin DNA prM-E dengue serotipe 2 (pUMD2.kl.20)dengan menganalisis sel T CD4, sel T CD8, IFN-γ dan TNF-α. pada sel U937 danPBMC secara in vitro, bertujuan untuk mengetahui respon imun ketika vaksindiinjeksikan ke dalam tubuh manusia. Dasar penelitian ini adalah sel U937ditransfeksi dengan pUMD2.kl.20 menggunakan lipofectamin. Sel U937 akanberperan sebagai APCs yang akan mengekspresikan protein prM-E DENV-2 danmempresentasikan protein tersebut melalui molekul MHC class I dan MHC classII kepada Peripheral Blood Mononuclear Cell (PBMC) manusia. Tahapan kerjayang dilakukan dalam penelitian ini terdiri dari: (a) kultur galur sel U937, (b)transfeksi sel U937 dengan pUMD2.kl.20, (c) transfeksi sel U937 dengan plasmids(pUMVC), (d) infeksi sel U937 dengan DENV-2 strain DS.18/09, (e) pewarnaandan pengamatan hasil pewarnaan menggunakan alat semi flowcytometri (TALI).pUMD2.kl.20 mengaktivasi sel T CD4 dan sel T CD8 untuk berploriferasi. Hasilpenelitian ini menunjukkan bahwa konsentrasi sel T CD8 lebih tinggi darikonsentrasi sel T CD4 dan konsentrasi sel positif yang mensekresikan IFNγ lebihtinggi dari konsentrasi sel positif yang mensekresikan TNFα. Kondisi optimal dariaktivasi sel T CD4 oleh pUMD2.kl.20 adalah 24 jam setelah penambahan PBMCsetelah transfeksi (8,53x10⁴sel/ml), untuk sel T CD8 adalah 24 jam setelahpenambahan PBMC setelah transfeksi (49,4x10⁴ sel/ml). Kondisi optimal dariaktivasi sel+ yang mensekresikan IFNγ oleh pUMD2.kl.20 adalah 24 jam setelahpenambahan PBMC 48 jam setelah transfeksi (9,86x10⁴ sel/ml), dan untuk sel+yang mensekresikan TNFα adalah 2 jam setelah penambahan PBMC 48 jamsetelah transfeksi (2,1x10⁴ sel/ml). Dari penelitian ini dapat disimpulkan bahwapUMD2.kl.20 bersifat imunogenik.

---

ABSTRACTDengue hemorrhagic fever (DHF) is a disease caused by infection with denguevirus (DENV), which is found in Indonesia. There is no specific therapy in thetreatment of DHF. An effort to develop an effective dengue vaccine is needed. Inthis research, analysis of the immunogenicity of the DNA vaccine candidate prMEdengue serotype 2 (pUMD2.kl.20) by analyzing the CD4 T cells, CD8 T cells,IFN-γ and TNF-α in U937 cells and PBMC in vitro, aims to determine theimmune response when the vaccine is injected into the human body. This researchapproach is based on transfection of U937 cells with pUMD2.kl.20 usinglipofectamin. U937 cells acts as APCs which will express the protein prM-EDENV-2 and presenting these proteins through the MHC class I and MHC class IImolecule to the Peripheral Blood Mononuclear Cell (PBMC) of human body.Stages of the work in this study consisted of: (a) culture cell line U937, (b)transfection of U937 cells with pUMD2.kl.20, (c) transfection of U937 cells withplasmid (pUMVC), (d) infection of U937 cells with DENV-2 strains DS.18/09,(e) staining and observation results of staining using a semi-flow cytometri(TALI). pUMD2.kl.20 activate CD4 T cells and CD8 T cells to proliferate. CD8 Tcells concentration higher than the concentration of CD4 T cells and the secretionof INFγ-positive cells concentration higher than the concentration of the secretionof TNFα-positive cells. Optimal condition of CD4 T cells activation bypUMD2.kl.20 is 24 hours after the addition of PBMC after transfection (8,53x10⁴cells/ml), for CD8 T cells was 24 hours after the addition of PBMC aftertransfection (49,4x10⁴ cells/ml). Optimal conditions secretion of IFNγ-positivecells were activated by pUMD2.kl.20 is 24 hours after the addition of PBMC 48hours after transfection (9,86x10⁴ cells/ml), and for the secretion of TNFα-positive cells were activated by pUMD2.kl.20 is 2 hours after the addition ofPBMC 48 hours after transfection (2,1x10⁴ cells/ml). From this study it can beconcluded that the pUMD2.kl.20 immunogenic, Dengue hemorrhagic fever (DHF) is a disease caused by infection with denguevirus (DENV), which is found in Indonesia. There is no specific therapy in thetreatment of DHF. An effort to develop an effective dengue vaccine is needed. Inthis research, analysis of the immunogenicity of the DNA vaccine candidate prMEdengue serotype 2 (pUMD2.kl.20) by analyzing the CD4 T cells, CD8 T cells,IFN-γ and TNF-α in U937 cells and PBMC in vitro, aims to determine theimmune response when the vaccine is injected into the human body. This researchapproach is based on transfection of U937 cells with pUMD2.kl.20 usinglipofectamin. U937 cells acts as APCs which will express the protein prM-EDENV-2 and presenting these proteins through the MHC class I and MHC class IImolecule to the Peripheral Blood Mononuclear Cell (PBMC) of human body.Stages of the work in this study consisted of: (a) culture cell line U937, (b)transfection of U937 cells with pUMD2.kl.20, (c) transfection of U937 cells withplasmid (pUMVC), (d) infection of U937 cells with DENV-2 strains DS.18/09,(e) staining and observation results of staining using a semi-flow cytometri(TALI). pUMD2.kl.20 activate CD4 T cells and CD8 T cells to proliferate. CD8 Tcells concentration higher than the concentration of CD4 T cells and the secretionof INFγ-positive cells concentration higher than the concentration of the secretionof TNFα-positive cells. Optimal condition of CD4 T cells activation bypUMD2.kl.20 is 24 hours after the addition of PBMC after transfection (8,53x10⁴cells/ml), for CD8 T cells was 24 hours after the addition of PBMC aftertransfection (49,4x10⁴ cells/ml). Optimal conditions secretion of IFNγ-positivecells were activated by pUMD2.kl.20 is 24 hours after the addition of PBMC 48hours after transfection (9,86x10⁴ cells/ml), and for the secretion of TNFα-positive cells were activated by pUMD2.kl.20 is 2 hours after the addition ofPBMC 48 hours after transfection (2,1x10⁴ cells/ml). From this study it can beconcluded that the pUMD2.kl.20 immunogenic]"

" ABSTRAK Dengue Hemorrhagic Fever (DHF) are viral diseases transmitted by mosquito vector spreads fastest in the world. Cause of dengue fever are RNA virus family Flaviviridae called dengue virus (DENV). DENV genome encodes three structural proteins, capsid (C), membrane proteins (prM), envelope protein (E) and seven nonstuktural protein NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4B, and NS5. NS3 protein contains many epitopes that can be recognized by the humoral and cellular immune system. Therefore NS3 protein is a potential target for development of dengue vaccines. This study begins by sequencing NS3 gene DENV-4 IDS 96/10. Phylogenetic analysis and epitope analysis were done from the result of sequencing. Phylogenetic analysis showed IDS 96/10 are in one clade with strains isolated rom China (2010), Singapore (2010) and Thailand (2000). NS3 gene DENV-4 IDS 96/10 contained epitopes recognized by CD4+ T cell that is epitope # 3 on the position of amino acids (213-227), # 9A (243-257), # 4 (251-265), # 5 (258-272), # 6 (266-280), # 7 (273-287) which has the same amino acid sequence comparison between strains. At position # 8 epitope (281-295) there are variation of amino acid sequence . Amino acids at positions 500-508 is recognized by CD8 + lymphocytes have the same sequence between strains were compared, and the amino acids at positions 526-531 which recognised by has the same amino acid sequence comparison between strains. Recognition of these epitopes by T lymphocytes and B lymphocytes can be the basis for the development of vaccines, especially vaccines for the Indonesian strain. Cloning of NS3 gene IDS 96/10 were done by using 3 strategies, digestion sticky end of vector and insert, digestion blunt end of vector and digestion blunt end vector then didefosforilation using CIAP. Three of these strategies have not been able to produce a recombinant plasmid pUMVD-4aNS3. Further optimization needs to be done to obtain clones containing the recombinant plasmid.

---

ABSTRACTDemam Berdarah Dengue (DBD) adalah penyakit yang disebabkan virus dengan vektor nyamuk yang paling cepat menyebar di duniaGenom DENV terdiri dari tiga protein struktural yaitu capsid (C), protein membran (prM), dan protein envelop (E) serta tujuh gen protein nonstuktural yaitu NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a,NS4b dan NS5. Protein NS3 mengandung epitop yang dapat dikenali oleh sistem imun humoral maupun selular. Oleh karena itu, protein NS3 merupakan target potensial bagi pengembangan vaksin dengue. Penelitian ini diawali dengan sekuensing pada gen NS3 DENV-4 IDS 96/10. Dari hasil sekuensing dilakukan analisis filogenetik dan analisis epitop. Analisis filogenetik menunjukkan gen NS3 IDS 96 /10 berada dalam satu clade dengan strain yang diisolasi dari Cina (2010), Singapore (2010) dan Thailand (2000). Pada gen NS3 DENV-4 IDS 96/10 terdapat epitop yang dapat dikenali oleh sel limfosit T CD4+ yaitu epitop #3 pada posisi asam amino (213-227) , #9A (243-257), #4 (251-265), #5 (258-272), # 6 (266-280), #7 (273-287) yang mempunyai urutan asam amino sama antar strain yang dibandingkan. Pada posisi epitop #8 (281-295) terdapatvariasi urutan asam amino. Asam amino pada posisi CD8+ mempunyai urutan yang sama antar strain yang dibandingkan,dan asam amino pada posisi 526-531 yang dikenali oleh limfosit B mempunyai urutan asam amino yang sama antar strain yang dibandingkan. Pengenalan epitop- epitop tersebut oleh limfosit T dan limfosit B menjadi dasar pengembangan vaksin khususnya vaksin yang khusus untuk strain Indonesia. Dilakukan pengklonaan gen NS3 IDS 96/10 dengan menggunakan 3 strategi, yaitu dengan digesti vektor dan insert dengan ujung sticky end, digesti vektor dengan ujung blunt end dan digesti vektor dengan ujung blunt end kemudian didefosforilasi menggunakan metode CIAP. Dengan ketiga strategi tersebut belum dapat menghasilkan plasmid rekombinan pUMVD-4aNS3. Perlu dilakukan optimasi lebih lanjut untuk mendapatkan klon yang berisi plasmid rekombinan.Demam Berdarah Dengue (DBD). Penyebab DBD adalahvirus RNA famili flaviviridae yang disebut virus dengue (DENV).500-508 dikenali oleh sellimfosit TCD8+ mempunyai urutan yang sama antar strain yang dibandingkan,dan asam amino pada posisi 526-531 yang dikenali oleh limfosit B mempunyai urutan asam amino yang sama antar strain yang dibandingkan. Pengenalan epitop- epitop tersebut oleh limfosit T dan limfosit B menjadi dasar pengembangan vaksin khususnya vaksin yang khusus untuk strain Indonesia. Dilakukan pengklonaan gen NS3 IDS 96/10 dengan menggunakan 3 strategi, yaitu dengan digesti vektor dan insert dengan ujung sticky end, digesti vektor dengan ujung blunt end dan digesti vektor dengan ujung blunt end kemudian didefosforilasi menggunakan metode CIAP. Dengan ketiga strategi tersebut belum dapat menghasilkan plasmid rekombinan pUMVD-4aNS3. Perlu dilakukan optimasi lebih lanjut untuk mendapatkan klon yang berisi plasmid rekombinan."

"Kondisi iklim tropis Indonesia menyebabkan Indonesia menjadi salah satu kontributor kasus infeksi DENV terbanyak. Saat ini diperlukan pengembangan vaksin yang harus didasari oleh studi filognetik virus, khususnya DENV serotipe 2 (DENV-2) yang merupakan DENV serotipe paling dominan di Indonesia. Penelitian ini bertujuan untuk menganalisa perbandingan sekuens dan filogenetik nukleotida Envelope lengkap dengan Domain III. Sejumlah 42 data diambil dari GenBank dan Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia berupa sekuens whole genome DENV-2. Sekuens tersebut diolah dengan software Genetyx 5.1. Hasil penelitian menunjukan strain Indonesia merupakan genotipe Cosmopolitan. Sedangkan analisis filogenetik Envelope lengkap dan Domain III menunjukkan perbedaan. Genotipe Asia II menjadi bagian genotipe American pada analisis filogenetik Domain III. Dari hasil penelitian dapat disimpulkan bahwa filogenetik Domain III saja tidak dapat digunakan untuk penentuan genotipe.

---

Indonesia's tropical climate conditions caused Indonesia become one of the largest contributors of DENV infection. Currently, we required the development of a vaccine that must be based on studies phylogenetic virus, in particular 2 DENV serotypes (DENV-2) which is the most predominant serotype DENV in Indonesia. This study aims to analyze the nucleotide sequence comparisons and phylogenetic complete Envelope with Domain III. A total of 42 data retrieved from GenBank and the Laboratory of Microbiology, Faculty of Medicine, University of Indonesia in the form of whole genome sequences of DENV-2. The sequence processed with GENETYX 5.1 software. The results showed Indonesia strain is part of Cosmopolitan genotype. Whereas the Envelope epitope analysis and the Domain III epitope analysis show significant differences. Genotype Asian II became part of the American genotype on phylogenetic analysis of Domain III. From the results of this study concluded that the phylogenetic domain III alone cannot be used for the determination genotpe."

"ABSTRAKVirus dengue DENV dapat menginfeksi manusia tanpa batasan usia di daerah tropis dan subtropis. Vaksin DENV dari keempat serotype sangat diperlukan untuk mencegah infeksi DENV. Tujuan dari penelitian ini untuk melihat respon imun seluler CD4, CD8, dan CD25 pada mencit yang diimunisasi dengan vaksin DNA pUMD4 kla/b. Plasmid pUMD4 kla/b diproduksi dan diisolasi dengan menggunakan berbagai metode. Uji ekspresi pUMD4 kla/b dilakukan dengan transfeksi pada sel Chinese Hamster Ovary. Plasmid yang telah mengekspresikan protein preM-E DENV-4 selanjutnya diimunisasikan pada mencit ddY pada hari ke-0, ke-21, dan ke-42. Hasil analisis limpa tanpa induksi dengan menggunakan uji flow cytometry menunjukkan persentase CD4 pada mencit yang diimunisasi lebih rendah jika dibandingkan dengan kelompok pUMVC4a dan kelompok tanpa imunisasi. Akan tetapi persentase CD8 dan CD25 menunjukkan hasil yang lebih tinggi jika dibandingkan dengan kelompok pUMVC4a dan kelompok tanpa imunisasi. Analisis limpa dengan induksi pada mencit yang diimunisasi sebesar 3,7 CD4 , 9,7 CD8 , dan 13 CD25 secara berurutan dan persentase CD4, CD8, dan CD25 lebih tinggi jika dibandingkan dengan kelompok pUMVC4a dan kelompok tanpa imunisasi setelah imunisasi ke-3. Kesimpulan penelitian ini adalah adanya aktivasi imun seluler pada mencit setelah imunisasi dengan pUMD4 kla/b.

---

ABSTRACTDengue virus infected humans in every ranges of ages at tropical and subtropical regions. In previous study DNA vaccine pUMD4 kla b was constructed. The purpose of this research is to inform cellular immune responses CD4, CD8, and CD25 in mice those were immunised by pUMD4 kla b. pUMD4 kla b plasmid was isolated by many methods. Expression test of pUMD4 kla b was held by transfection on CHO cells. pUMD4 kla b that had expressed preM E dengue proteins was immunised in ddY mice in aged 5 6 weeks on day 0, day 21, and day 42. Evaluation of immunizations could be seen from flow cytometry test on mice rsquo s splenocytes. pUMD4 kla b could express preM E dengue proteins. Result showed enhancements on percentages rsquo numbers of CD4 cells 2.6 , CD8 cells 4.4 , and CD25 6 in ddY mice without induction, and CD4 cells 3.7 , CD8 cells 9.7 , and CD25 13 with induction after third immunizations. Percentages of CD4, CD8, and CD25 in pUMD4 kla b rsquo s immunizations are higher than in pUMVC4a rsquo s immunizations and without immunizations. Conclusion there were cellular immunity activations after immunized with pUMD4 kla b."

"Demam Dengue (DD) dan Demam Berdarah Dengue (DBD) adalah penyakit yang tersebar luas. Penelitian ini dilakukan untuk mengembangkan kandidat vaksin dengue nasional berbasis protein sub unit prM/E DEN-4. Protein prM/E adalah kompleks unik yang berperan penting dalam perakitan virus dan modulasi fusi. Penelitian telah dilakukan dengan metode Gateway cloning system untuk menklon gen prM/E dalam plasmid cloning pDONR221 kemudian dilakukan subkloning dan dipindahkan gen prM/E ke dalam plasmid eksperesi pET-55-DEST. Ekspresi protein prM/E dilakukan di dalam E.coli BL21 (DE3) dengan induksi Isoprophyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG). Pendeteksian poliprotein Gag hasil ekspresi dilakukan dengan metode Sodium Dodecyl Sulphate Polyacrilamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE). Setelah protein prM/E berhasil dideteksi kemudian protein prM/E dipurifikasi dengan menggunakan metode immobilized metal affinity chromatography (IMAC) di bawah kondisi denaturasi. Hasil penelitian yaitu protein prM/E dapat diekspresikan dalam E.coli BL21 (DE3) dengan berat molekul ~75 kDa.

---

Dengue Fever is an infectious disease caused by one of the four serotypes of dengue virus (DENV). Until now, no licensed vaccines or antivirus is available commercially. Because of that, this research was aimed to develop candidate vaccine dengue based on protein subunit pre-membrane and Envelope (prM/E). Protein prM/E is a unique complex which has important role in virus assemblyand host cell entry. The recombinant protein development was done using Gateway cloning system. This was used to clone the prM/E gene into pDONR221 plasmid. The cloned gene was then transferred into pET-55-DEST expression plasmid. Expression of protein prM/E was perfomed in E. coli BL21 (DE3) with inducer Isoprophyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG). Sodium Dodecyl Sulphate Polyacrilamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) method was used to detect the expressed prM/E protein. Upon detection of prM/E protein with SDS-PAGE, the recombinant protein was purified by using immobilized metal affinity chromatography (IMAC) method under denature condition. Using these methods, the prM/E protein was successfully expressed in E.coli BL21 (DE3) with a molecular weight ~75 kDa."

"

Chikungunya merupakan penyakit menular yang bersifat re-emerging atau penyakit lama yang dapat tersebar kembali. Penyakit yang disebabkan virus chikungunya ini memiliki manifestasi klinis non-spesifik sehingga dibutuhkan metode diagnosis yang cepat dan akurat. Protein E2 yang dikode oleh gen E2 pada virus chikungunya berperan penting sebagai pengikatan reseptor sehingga berpotensi untuk digunakan dalam proses diagnosis penyakit chikungunya. Penelitian ini bertujuan menghasilkan protein rekombinan E2 sebagai bahan dasar produksi antibodi monoklonal yang akan digunakan dalam pengembangan perangkat diagnostik penyakit chikungunya. Metode penelitian yang dilakukan mencakup pembentukan plasmid rekombinan pPICZaA-E2, transformasi plasmid rekombinan pada sel inang Escherichia coli, analisis koloni transforman, transformasi plasmid rekombinan pada sel inang ekspresi Pichia pastoris X-33, analisis fenotipe, hingga ekspresi protein rekombinan E2. Hasil penelitian menunjukkan 281 koloni E. coli transforman pPICZaA-E2 dapat tumbuh pada medium yang mengandung antibiotik zeocin. Hasil analisis PCR koloni transforman menunjukkan gen E2 dengan ukuran 1.260 bp berhasil ditransformasikan ke sel inang E. coli menggunakan vektor pICZaA dengan ukuran 3.569 bp. Hasil analisis PCR genom berhasil mengamplifikasi gen AOX1 berukuran 2,2 kb dan 1,8 kb yang menunjukkan plasmid rekombinan berhasil terintegrasi pada genom P. pastoris dan menghasilkan fenotipe Mut⁺. Pita protein berukuran 40 kDa pada hasil SDS-PAGE menunjukkan protein E2 berhasil terekspresi.

---

Chikungunya is known as an infectious, re-emerging disease. Because of the non-specific clinical manifestation, chikungunya needs a rapid and accurate diagnostic method for its detection. Envelope 2 (E2) protein coded by E2 gene in the genome of the virus has an important role as an attachment receptor to a cell that made it potential to be used for diagnosis. This research is aimed to obtain E2 recombinant protein as a basic material for monoclonal antibody production in chikungunya rapid diagnostic test kit development. Chikungunya E2 gene is amplified and ligated with pPICZaA vector to make recombinant DNA clones from E. coli. The clones then isolated and used for protein expression in P. pastoris. The result shows 281 transformants of E. coli colonies can grow on a selection medium that contains zeocin. Analysis of direct colony PCR show E2 gene was transformed and cloned using pPICZaA vector. Analysis of genomic PCR shows 2,2 kb and 1,8 kb bands formed that indicate AOX1 gene was amplified and the integration of recombinant plasmid pPICZaA to P. pastoris genome was successful. Visualization of protein electrophoresis shows protein band was formed at the size of40 kDa that indicate the protein expression was successful.

"